一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法，解决了现有技术中存在组织修复情况还不尽人意，瘢痕形成明显，视功能恢复不理想的问题。本发明专利技术包括细胞培养液，所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。本发明专利技术具有显著提高角膜修复效果等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法
本专利技术涉及一种滴眼液，具体涉及一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法。
技术介绍
眼睛的健康问题与视力的好坏紧密联系的，如果眼睛出现损伤的话，视力会大大的受到影响。角膜损伤约占严重眼外伤中51％。角膜是重要的屈光介质，角膜损伤后可能形成不同程度的瘢痕，或角膜曲率的改变，严重影响视力。因此，角膜外伤的及时修复能最大限度地减少瘢痕和散光形成，以保留和恢复视功能。角膜损伤的常见因素包括：烧伤、外伤与感染等因素，常见的症状有眼睛流泪、疼痛等。如果是被紫外线损伤的话，会出现角膜上皮的损害，出现眼睑红肿、结膜充血、眼镜异物感很重，畏光、流泪等，还伴有视物模糊。现在临床常用的修复类眼药水有主要由重组牛碱性成纤维细胞生长因子构成的贝复舒滴眼液，和主要由重组人表皮生长因子构成的易贝滴眼液等。它们都是基因工程表达的细胞因子药物，已经证实一定的临床安全性及有效性，但对一些较严重的角膜损伤病例，组织修复情况还不尽人意，瘢痕形成明显，视功能恢复不理想。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：现有技术中存在组织修复情况还不尽人意，瘢痕形成明显，视功能恢复不理想的问题，目的在于提供了临床修复效果更明显的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法。本专利技术通过下述技术方案实现：一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。本专利技术通过培育脂肪细胞获得的细胞培养液，能达到更好地组织修复效果，并且，通过表1中实施例1-5的效果对比可知：本专利技术中细胞培养液能更好地促进角膜组织的修复，修复效果极佳。进一步，所述间充质干细胞无血清培养基中还添加有GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif；hrEGF添加后的终浓度为0.1～0.2μg/mL，bFGF添加后的终浓度为0.02～0.06μg/mL，hLif添加后的终浓度为0.01～0.06μg/mL。通过上述hLif的作用，能有效达到抑制干细胞分化，保存干细胞干性的作用。并且，通过表1中实施例1～3的效果对比可知：本专利技术中的细胞培养液与hrEGF、bFGF和hLif之间存在相互促进的作用，效果极佳。即，通过上述条件的设置，能使本专利技术的修复效果达到最佳，效果更加显著。更进一步地，所述浓缩的倍数为2～8倍。所述浓缩的方式采用冷冻真空干燥方法。一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，包括：取脂肪细胞，进行脂肪细胞的清洗，然后加入等体积的胶原酶进行消化；进行消化后细胞的清洗，离心去上清液，重悬后转入间充质干细胞无血清培养基中进行培育，细胞传代至3～6代时，进行细胞鉴定，当细胞密度达到90％以上后获得培养上清液；将培养上清液浓缩后制成细胞培养液。所述间充质干细胞无血清培养基中还添加有GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif；hrEGF添加后的终浓度为0.1～0.2μg/mL，bFGF添加后的终浓度为0.02～0.06μg/mL，hLif添加后的终浓度为0.01～0.06μg/mL。通过上述各组成成分和配比的结合，能极大地提高修复效果，恢复效果极其显著。进一步，所述胶原酶采用I型胶原酶，消化时间为50～70分钟，所述I型胶原酶的浓度为0.2％～0.3％。更进一步，所述清洗采用生理盐水进行处理；消化后细胞清洗完成后再在2000rpm的条件下离心5min，去除上清液。所述重悬时采用间充质干细胞无血清培养基进行处理，间充质干细胞无血清培养基重悬后转入T75培养瓶中进行培养。优选地，所述上清液采用冷冻真空干燥方法进行浓缩，浓缩的倍数为2～8倍；浓缩后经过0.22μm的除菌滤器，过滤除菌制成成品。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：1、本专利技术通过培育脂肪细胞获得的细胞培养液合，能达到更好地角膜组织修复效果，并且本专利技术中的脂肪细胞通过包含有hrEGF、bFGF和hLif的间充质干细胞无血清培养基培育后，能够使脂肪细胞培养液与添加的生长因子之间存在相互促进的效果，效果极佳。2、本专利技术不存在免疫排斥等问题，具有强大的细胞再生与修复的作用，效果十分显著。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为实施例1的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。图2为实施例2的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。图3为实施例3的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。图4为实施例4的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。图5为实施例5的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。实施例1一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。上述细胞培养液的制备方法，具体如下：取脂肪20ml，用生理盐水清洗两次，然后加入等体积的浓度为0.25％的I型胶原酶进行消化，消化过程中反复震荡，消化60min后，再加入等体积的原代培养基终止消化，反复吹打混匀后，采用生理盐水进行细胞的清洗，2000rpm离心5min后去上清液，再次加入生理盐水进行细胞的清洗，2000rpm离心5min后去上清液，沉淀采用间充质干细胞无血清培养基重悬，重悬后转入盛装有间充质干细胞无血清培养基的T75培养瓶中进行培育，细胞进行传代，4代时进行细胞鉴定，当鉴定出细胞密度达到90％以上后，获取培养上清液；采用冷冻真空干燥方法对培养上清液进行浓缩，浓缩6倍后制成细胞培养液。本实施例中该间充质干细胞无血清培养基采用CellGenix开发的间充质干细胞无血清培养基。实施例2本实施例与实施例1的区别在于，间充质干细胞无血清培养基的组成成份不同，具体设置如下：一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，上述细胞培养液的制备方法为：取脂肪20ml，用生理盐水清洗两次，然后加入等体积的浓度为0.25％的I型胶原酶进行消化，消化过程中反复震荡，消化60min后，再加入等体积的原代培养基终止消化，反复吹打混匀后，采用生理盐水进行细胞的清洗，2000rpm离心5min后去上清液，再次加入生理盐水进行细胞的清洗，2000rpm离心5min后去上清液，沉淀采用间充质干细胞无血清培养基重悬，重悬后转入盛装有间充质干细胞无血清培养基的T75培养瓶中进行培育，细胞进行传代，4代时进行细胞鉴定，当鉴定出细胞密度达到90％以上后，获取培养上清液；采用冷冻真空干燥方法对培养上清液进行浓缩，浓缩6倍后制成细胞培养液。本实施例中该间充质干细胞无血清培养基包括CellGenix开发的间充质干细胞无血清培养基，并且在CellGen本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。

【技术特征摘要】
1.一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。2.根据权利要求1所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，其特征在于，所述间充质干细胞无血清培养基中还添加有GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif；hrEGF添加后的终浓度为0.1～0.2μg/mL，bFGF添加后的终浓度为0.02～0.06μg/mL，hLif添加后的终浓度为0.01～0.06μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，其特征在于，所述浓缩的倍数为2～8倍。4.根据权利要求1所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，其特征在于，所述浓缩的方式采用冷冻真空干燥方法。5.一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，其特征在于，包括：取脂肪细胞，进行脂肪细胞的清洗，然后加入等体积的胶原酶进行消化；进行消化后细胞的清洗，去上清液，重悬后转入间充质干细胞无血清培养基中进行培育，细胞传代至3～6代时进行细胞鉴定，当细胞密度达到90％以上后获得培养上清液；将培养上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨远，冯宇梁，徐子林，于洪涛，李昕怡，
申请(专利权)人：成都远山博桥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51