蛋白质的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质的生产方法，所述方法包括将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性CHO细胞中、将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该CHO细胞的染色体中、对生产该目标蛋白质的悬浮性CHO细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质；得到所述悬浮性CHO细胞的方法；所述悬浮性CHO细胞以及一种表达载体。

Production methods of protein

The invention relates to a production method of protein, the method includes the gene fragments encoding the target protein containing DNA and at both ends of the gene fragment containing a sequence of transposon expression vector into at least a suspension of CHO cells, the gene fragment was inserted between a pair of transposon sequences with the DNA encoding the target protein to the suspension of CHO cells on the production of the target protein, the CHO cell suspension culture and chromosome production of the target protein by the method of suspension; CHO cells; the suspension of CHO cells and an expression vector.

【技术实现步骤摘要】
蛋白质的生产方法本申请是申请日为2011年12月14日、国际申请号为PCT/JP2011/078935、中国国家阶段申请号为201180060832.7、专利技术名称为“蛋白质的生产方法”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性哺乳动物细胞中、将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中的方法、对生产该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该蛋白质的方法、表达该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞以及包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
技术介绍
利用基因重组技术的外源蛋白质的生产在药品和食品行业等各种产业中得到利用。多数情况下，重组蛋白质的生产通过如下方法进行：将含有编码目标蛋白质的碱基序列的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞等宿主中，选择出该表达载体重组到染色体中而得到的转化株，再将该转化株在适当的培养条件下培养而使其表达目标蛋白质。但是，为了开发出能够高效地生产外源蛋白质的宿主，需要根据每种目标蛋白质选择出生产率良好的宿主细胞，因而期望对各个宿主中的外源蛋白质生产技术进行进一步的技术革新。大肠杆菌等细菌和酵母的系统与动物细胞不同，大多难以进行糖链修饰等翻译后修饰，在生产具有活性的蛋白质的方面成为问题。昆虫细胞的系统具有如下优点：所生产的蛋白质接受磷酸化、糖链附加等翻译后修饰，能够在保持原有的生理活性的状态下进行表达。但是，分泌蛋白质的糖链结构与来源于哺乳类的细胞的糖链结构不同，因此，用于药品用途时抗原性等成为问题。另外，昆虫细胞的系统在外源基因的导入中使用重组病毒，因此，从安全性的观点出发，存在需要使其灭活或将其包埋的问题。对于动物细胞的系统而言，能够以更等同于生物体中制造的蛋白质的方式对以人类为代表的高等动物来源的蛋白质进行磷酸化、糖链附加、折叠等翻译后修饰。这种准确的翻译后修饰是在重组蛋白质中重现蛋白质本来具有的生理活性所必需的，对于需要这种生理活性的药品等，经常使用以哺乳动物细胞为宿主的蛋白质生产系统。但是，以动物细胞为宿主的蛋白质表达系统的生产率一般较低，导入基因的稳定性也大多存在问题。提高以哺乳动物培养细胞为宿主的蛋白质的生产率不仅在治疗用药品或诊断药品等的制造中非常重要，对于它们的开发研究也有很大贡献。因此，当务之急是开发以哺乳动物培养细胞、特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主且能够容易地获得高生产株的基因表达系统。转座子是能够从染色体的一个基因座移动到另一个基因座的转座性遗传因子。转座子是分子生物学或遗传学的研究中强有力的工具，基于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作等目的用于昆虫或线虫(例如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans))和植物中，但这种技术的开发在包括哺乳动物细胞在内的脊椎动物中很缓慢。但是，近年来，在脊椎动物中也报道了具有活性的转座子，并且确认了其中若干转座子在小鼠或人类等的哺乳动物细胞中也具有活性。作为代表性的转座子，可以列举：由青鳉克隆得到的转座子Tol1(专利文献1)、Tol2(非专利文献1)、由存在于鲑科鱼类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(SleepingBeauty)(非专利文献2)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frogprince)(非专利文献3)、昆虫来源的转座子piggyBac(非专利文献4)。这些DNA转座子作为用于给哺乳动物细胞的基因组带来新的表现型的基因导入工具已经用于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作、表达抗药性蛋白质等(非专利文献5～12)。对于昆虫而言，研究了使用鳞翅目昆虫来源的转座子piggyBac将外源基因导入家蚕染色体并使其表达该外源基因所编码的蛋白质的方法，并公开了使用该技术的蛋白质生产方法(专利文献2)。但是，由于所表达的目标蛋白质的表达量不充分且在家蚕全身都有生产，因此，为了从存在大量杂质蛋白质的体液中以高纯度的形式回收表达的外源蛋白质，需要高度的纯化技术，因此在经济方面存在问题。另外，已知使用来源于青鳉的Tol2转座子在哺乳动物细胞中表达与G418抗性相关的蛋白质的例子(非专利文献12、非专利文献13)。在利用来源于哺乳动物的培养细胞生产医疗用蛋白质药品的情况下，为了防止未知病毒或者病原性多肽的不可预期的混入，重要的是在其生产步骤中不含来源于动物的成分。CHO细胞作为生产蛋白质药品的动物细胞最频繁地使用，通过近年的研究，也确立了能够在不使用血清或来源于动物的成分的安全的培养基中培养的悬浮性CHO细胞株。但是，在无血清/无蛋白质条件下进行基因导入而得到的细胞株止于在使用血清的条件下进行基因导入而得到的细胞株的一半的生产率(非专利文献14)，表明在无血清/无蛋白质条件下的基因导入在技术上困难。通常而言，用于筛选表达目标蛋白质的细胞的选择标记配置在同一基因表达载体上。这基于如下假说：在基因组中存在的基因具有容易表达的位点和不易表达的位点(被称为位置效果，非专利文献15)，如果表达选择标记，则也表达目标蛋白质。另一方面，还已知：如抗体等那样，目标蛋白质由多个多肽构成的情况下，使它们分别用不同的载体表达。在抗体的情况下，抗体的重链的表达与轻链的表达相比越高，则表示生产率越高(非专利文献16)。预测在同一载体上重链与轻链的表达一定，为了得到高生产率，通过故意地使重链和轻链用不同的载体表达，结果能够得到以最佳的比表达的细胞株。但是，在用多个不同的载体表达蛋白质的情况下，也需要多个选择标记基因。作为克服其的方法，报道了如下例子：将本来由一条多肽链构成的dhfr基因分割成两条多肽链，在重链表达载体上配置一条多肽链，在轻链表达载体上配置另一条多肽链(非专利文献17)。但是，在非专利文献17中记载的细胞是添加在培养基中的蛋白质成分依赖性的CHO细胞，如上所述，与无血清/无蛋白质条件下的基因导入的情况不同，存在基因导入效率高的可能性。仍然预测在不存在病毒感染等危险性的安全性高的无血清/无蛋白质条件下进行基因导入时，难以筛选出生产率高的细胞。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2008/072540号专利文献2：日本特表2001-532188号公报非专利文献非专利文献1：Nature383,30(1996)非专利文献2：Cell91,501-510(1997)非专利文献3：NucleicAcidsRes,31,6873-6881(2003)非专利文献4：InsectMol.Biol.5,141-151(1996)非专利文献5：Genetics.166,895-899(2004)非专利文献6：PLoSGenet,2,e169(2006)非专利文献7：Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,10769-10773(1998)非专利文献8：Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6759-6764(2001)非专利文献9：Nature436,221-226(2005)非专利文献10：NucleicAcidsRes,31,687本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产抗体的方法，其中，将包含含有编码抗体的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性CHO细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码所述抗体的DNA的基因片段重组到所述CHO细胞的染色体中，得到表达该抗体的CHO细胞，并且对该CHO细胞进行悬浮培养而生产该抗体，其中表达载体选自下述(a)～(d)：(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；和(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，和其中一对转座子序列为一对来源于Tol1转座子的核苷酸序列或者来源于Tol2转座子的核苷酸序列。...

【技术特征摘要】
2010.12.15 JP 2010-2798491.一种生产抗体的方法，其中，将包含含有编码抗体的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性CHO细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码所述抗体的DNA的基因片段重组到所述CHO细胞的染色体中，得到表达该抗体的CHO细胞，并且对该CHO细胞进行悬浮培养而生产该抗体，其中表达载体选自下述(a)～(d)：(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；和(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，和其中一对转座子序列为一对来源于Tol1转座子的核苷酸序列或者来源于Tol2转座子的核苷酸序列。2.一种生产抗体的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)～(C)：(A)将以下的表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性CHO细胞中，(a)包含含有编码抗体的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，(b)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；(B)利用步骤(A)中导入到CHO细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该CHO细胞的染色体中而得到表达所述抗体的悬浮性哺乳动物细胞；以及(C)对步骤(B)中得到的表达抗体的CHO细胞进行悬浮培养而生产所述抗体，其中表达载体选自下述(a0)～(d0)：(a0)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；(b0)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；(c0)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；和(d0)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，和其中一对转座子序列为一对来源于Tol1转座子的核苷酸序列或者来源于Tol2转座子的核苷酸序列。3.一种得到生产抗体的悬浮性CHO细胞的方法，其中，将包含含有编码抗体的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性CHO细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码抗体的DNA的基因片段重组到该CHO细胞的染色体中，其中表达载体选自下述(a)～(d)：(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；和(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，和...

【专利技术属性】
技术研发人员：川上浩一，黑川惠，山口惠奈，小川梨沙，塚原正义，林洋子，
申请(专利权)人：大学共同利用机关法人情报·系统研究机构，协和发酵麒麟株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP