一种化学修饰UNG酶及其修饰方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种化学修饰UNG酶，所述化学修饰UNG酶是由酸酐修饰的UNG酶。所述化学修饰UNG酶能在某一温度或以下不表现酶活性，而在特定温度下孵育一段时间后去修饰可以恢复正常活性，从而实现活性可控。本发明专利技术还提供一种用酸酐修饰UNG酶的方法、以及所述化学修饰UNG酶的应用。本发明专利技术的用酸酐修饰UNG酶的方法，可以制备的化学修饰UNG酶。所述化学修饰UNG酶用于EMA(多酶介导的核酸常温扩增)或其它核酸等温扩增方法中，可防止扩增产物污染反应体系和环境，耗时短，操作简单，活性可控。

A chemically modified UNG enzyme and its modification methods and Applications

The present invention discloses a chemically modified UNG enzyme, the chemically modified UNG enzyme is a UNG enzyme modified by anhydride. The chemically modified UNG enzyme can not show enzyme activity at a certain temperature or below, but can be restored to normal activity after incubation for a period of time at a specific temperature, so as to realize the controllable activity. The present invention also provides a method for modifying UNG enzyme with anhydride, and the application of the chemically modified UNG enzyme. The chemically modified UNG enzyme can be prepared by the method of modifying UNG enzyme with anhydride. The chemical modification of UNG enzyme EMA (nucleic acid at room temperature for enzyme mediated amplification) or other nucleic acid isothermal amplification method, which can prevent the amplification reaction system and environmental pollution, short time, simple operation, controllable activity.

【技术实现步骤摘要】
一种化学修饰UNG酶及其修饰方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种化学修饰UNG酶及其修饰方法、在核酸扩增中的应用。
技术介绍
PCR是一种极灵敏的扩增技术，易受污染的影响，小量的外源DNA污染就可以与目的模板一起被扩增，从而影响扩增结果和判断。当前一次扩增产物由于误操作(主要是以气溶胶的形式)而进入新的扩增反应时，会发生共同来源的污染，这称之为残余污染；从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。由于扩增产物的量大且非常容易以气溶胶的形式扩散，即使实验室严格分区，也难免因为误操作而受到污染。为保证PCR结果的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)(也称为UDG，Uracil-DNAGlycocasylase，以下简称为UNG酶)和Taq酶热启动。UNG酶是克隆有Uracil-N-Glycosylase基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dUMP的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。本专利技术所用的UNG酶是Thermusaquaticus在大肠杆菌中表达的，最佳活性温度为50-65℃，95℃下10分钟灭活。UNG酶防污染技术原理是在扩增过程中以脱氧尿苷(dUTP)代替脱氧胸苷(dTTP)，或者以一定比例把dUTP加入到dNTP中，从而得到含有dUMP的扩增产物。尿苷酶(UNG)能特异地破坏含有dUMP的DNA产物，使之不能作为扩增模版，但对天然的不含dUMP的核酸不起作用。故只要在扩增反应前加入UNG酶，就可以破坏过往扩增反应残余的含有d-UMP的DNA，但对不含d-UMP的目标DNA不起作用，从而使目标DNA得到扩增。随后将UNG酶高温灭活，再进行扩增。这样就可以有效地防止实验室内扩增产物的残余污染，避免假阳性的出现。现有技术将UNG酶运用于PCR扩增防污染，在PCR开始前增加30℃～37℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的dUMP的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这一步骤的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增。这个处理对PCR有效，但是却无法用于等温或常温扩增。由于UNG酶在一定温度范围内(30℃-90℃)均有活性，在PCR扩增的时候，dUTP掺入扩增产物过程中，UNG酶会切除该碱基，影响最终扩增效率，因此在普通PCR开始之前，必须有一步热处理使UNG变性而失活。变性的温度要求较高(95℃左右)，而等温反应的酶在这样温度下会失活。同时，PCR防污染体系在扩增检测之前，增加了检测的时间，虽然高温下，UNG酶会变性失活，但是也有报道提示残留的UNG酶活性会干扰后续的扩增检测。恒温扩增的防污染的方法如美国专利(专利号US8945845B2)披露的需要开管加入UNG酶，然后加入反应试剂和UNG酶抑制剂，需要开管两次，增加了实验操作步骤和核酸泄漏风险，延长检测时间。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术的目的是提供一种化学修饰UNG酶、化学修饰方法以及化学修饰UNG酶的应用。这种化学修饰UNG酶能在低于某一温度下不表现酶活性，而在该温度以上孵育一段时间后去修饰就可以恢复正常活性，从而实现活性可控。该化学修饰UNG酶应用于常温或等温扩增中，可建立核酸常温或等温扩增的防污染体系，耗时短，操作简单，有效清除残余污染。为达到以上技术目的，本专利技术的技术方案是，一种化学修饰UNG酶，所述化学修饰UNG酶是用酸酐修饰的UNG酶。优选的，所述用于化学修饰UNG酶的酸酐是柠康酸酐、马来酸酐或者马来酸酐的衍生物。优选的，所述马来酸酐的衍生物是其2’位、3’位具有官能取代物，或者2’3’位同时具有官能取代物，如2，3-二甲基马来酸酐。所述化学修饰UNG酶的酸酐具有以下结构式：其中，R1、R2可以为H、CH3、CH3CH2，或F，Cl。但R1、R2不限于这些基团。优选的，所述化学修饰UNG酶具有45℃-70℃的热启动温度。柠康酸酐、马来酸酐或其衍生物能与UNG酶的赖氨酸中的氨基进行反应，使赖氨酸残基的净电荷发生改变，失去活性。通过控制修饰的条件，能保证UNG酶在某一温度或以下不表现酶活性，而在特定温度下孵育一段时间后去修饰，UNG酶即恢复正常活性。本专利技术采用不同的酸酐及不同的酸酐量修饰UNG酶，可以使UNG酶在正常扩增时(37℃-42℃)无活性，通过升温处理(45℃-70℃)5-10min后，化学修饰UNG酶有活性从而能降解扩增产物。本专利技术还提供一种化学修饰UNG酶的方法，所述方法包括以下步骤：UNG酶预冷→化学修饰→修饰酶纯化→收集纯化酶。具体的，所述化学修饰UNG酶的方法包括以下步骤：1)、UNG酶预冷：将UNG酶于冰上静置；2)、化学修饰：于冰上向UNG酶中加入用于修饰的酸酐，再加入NaOH并维持pH在7.5-9.0之间；3)、修饰酶纯化：将上步所得UNG酶转移至透析袋并加入Tris-KAc溶液后封口，放入4℃的Tris(pH7.5-9.0)和KAc溶液中透析；或将上步所得UNG酶通过G-25分子筛纯化；4)、收集纯化酶，将经过透析或纯化的酶收集，离心除去不溶沉淀，取上清分装，即是以酸酐修饰的UNG酶。优选的，所述用于修饰的酸酐是柠康酸酐、马来酸酐或者马来酸酐的衍生物。优选的，所述化学修饰UNG酶具有45℃-70℃的热启动温度。本专利技术还提供一种化学修饰UNG酶的应用，所述化学修饰UNG酶用于核酸常温扩增或等温扩增中降解扩增产物；所述化学修饰UNG酶是由柠康酸酐、马来酸酐或者马来酸酐的衍生物修饰的UNG酶；本专利技术还提供一种EMA防污染扩增反应体系，每10μl所述EMA防污染扩增反应体系包括4mM巯基乙醇，50μMdNTPs，1mMATP，20nM真核DNA扩增环状复合物，40nM增殖细胞核抗原，20nMpolδ复合酶，0.4μM真核DNA复制蛋白A，20nMT4噬菌体紫外敏感蛋白1，20nMT4噬菌体紫外敏感蛋白2，200nM正反向引物，DNA模板，200μMdUTP，10ng/ul化学修饰UNG酶。常温核酸扩增技术(Enzymes-Mediated-Amplification，EMA)，以下简称EMA技术，是一种新型核酸扩增技术(参见专利CN104059905)，EMA技术利用DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及其他辅助因子，可达到在一定温度范围内(30-42℃)、30分钟内使目的DNA片段扩增数百万倍。该方法操作简单、扩增时间短、仪器要求低，非常适合用于疾病的快速诊断。在现有技术中，UNG酶无法应用于常温扩增体系的污染防控，因为常温扩增没有95℃变性和热启动这一步骤，UNG酶没有经热处理而变性失活，会影响扩增效果，使扩增结果难以判定。本专利技术的经化学修饰的UNG酶能在某一温度(如45℃或70℃)及以下不表现酶活性，而在特定温度或以上孵育一段时间后去修饰就可以恢复正常活性，而且此特定温度大大低于95℃，使本专利技术所述化学修饰UNG酶可应用于常温或等温扩增中，使核酸常温或等温扩增防污染扩增体系，耗时更短，操作简单，清晰判定结果。本专利技术选择柠康酸酐、马来酸酐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化学修饰UNG酶，其特征在于，所述化学修饰UNG酶是用酸酐修饰的UNG酶。

【技术特征摘要】
1.一种化学修饰UNG酶，其特征在于，所述化学修饰UNG酶是用酸酐修饰的UNG酶。2.如权利要求1所述的化学修饰UNG酶，其特征在于，所述用来化学修饰UNG酶的酸酐是柠康酸酐、马来酸酐或者马来酸酐的衍生物。3.如权利要求1所述的化学修饰UNG酶，其特征在于，所述化学修饰UNG酶的酸酐具有以下结构式：其中，R1、R2可以为H、CH3、CH3CH2，或F、Cl。4.如权利要求1～3任一所述的化学修饰UNG酶，其特征在于，所述化学修饰UNG酶具有45℃-70℃的热启动温度。5.一种化学修饰UNG酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：UNG酶预冷→化学修饰→修饰酶纯化→收集纯化酶。6.如权利要求5所述的化学修饰UNG酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)、UNG酶预冷：将UNG酶于冰上静置；2)、化学修饰：于冰上向UNG酶中加入用于修饰的酸酐，再加入NaOH并维持pH在7.5-9.0之间；3)、修饰酶纯化：将上步所得UNG酶转移至透析袋并加入Tris-KAc溶液后封口，放入4℃的pH7.5-9.0的Tri...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡振新，谭卓，郜安国，
申请(专利权)人：苏州点晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32