一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法技术

本发明专利技术涉及由牛磺熊去氧胆酸的制备方法，属于生物技术领域，采用同时表达7α‑羟基类固醇脱氢酶(7α‑HSDH)和7β‑羟基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)基因的大肠杆菌进行液体发酵，直接将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，稳定、可控，转化率高，简单、快捷，条件温和，无污染，牛磺鹅去氧胆酸来源于鸡胆汁、鹅胆汁或鸭胆汁，易于获得，对牛磺熊去氧胆酸的理论研究及其药用价值的广泛利用具有重要意义。

A method for preparation of ursodeoxycholic acid

The present invention relates to a preparation method of tauroursodeoxycholic acid, which belongs to the field of biotechnology, the simultaneous expression of 7 alpha hydroxysteroid dehydrogenase (7 alpha HSDH) and 7 beta hydroxysteroid dehydrogenase (7 P HSDH) gene in Escherichia coli by liquid fermentation, directly TCDCA into tauroursodeoxycholic deoxycholic acid, stable and controllable, high conversion rate, simple and convenient, mild condition, no pollution, taurochenodeoxycholic acid derived from chicken, duck or goose bile bile bile, easy to obtain, theory of Niu Huangxiong and its medicinal value of ursodeoxycholic acid application has important significance.

【技术实现步骤摘要】
一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法
本专利技术涉及一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，具体说，是涉及一种通过遗传改造的非致病性微生物进行的将牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)原位转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的方法，属于生物

技术介绍
以外源性的天然或合成的有机化合物为底物，添加至处于生长状态的生物体系或酶体系中，在适宜的条件下进行培养，使得底物与生物体系中的酶发生相互作用，从而产生结构改变，这一过程称为生物转化。生物转化以多种不同催化功能的酶体系对中药化学成分进行转化，可以产生新的天然化合物，或提高中药有效成分的水溶性，降低化合物的毒性，再通过与药理筛选手段相结合，可从中找到新的高活性或低毒性的天然活性先导化合物。牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，是熊胆中的主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶解胆石等作用。2007年以商品名滔罗特(Taurolite)获准在中国销售，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等常见疾病，且得到较好的疗效。TUDCA与牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)结构上是7位羟基的差向异构，二者的化学结构式如下：目前，除了采用“活熊引流取胆”法得到牛磺熊去氧胆酸，还可以通过化学合成法来制备。“活熊引流取胆”备受争议，化学合成法也因步骤繁琐，或成本高，或收率低，且要使用大量有机溶剂，不利于分离纯化得到无毒害的下游产物。因此，应用中药生物技术将TUDCA在生物工程菌中高效表达，实现大规模工业化发酵生产是解决问题的有效途径。另一方面，对降低获取TUDCA的成本，简化获取步骤，提高TUDCA的质量也具有重要意义。TCDCA是一种广泛存在于鸡、鸭、鹅等禽畜胆汁中的胆酸类化合物，利用TCDCA作为原料，直接以遗传改造的大肠杆菌作为转化菌株，制备TUDCA的方法至今尚未见到有关报道，且可以实现资源合理利用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于采用基因工程方法遗传改造大肠杆菌，并通过微生物发酵，将牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)原位转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：为工程菌直接发酵转化法，包括7α-HSDH和7β-HSDH基因密码子优化、工程菌的构建、工程菌培养、底物的转化及产物制备。所述工程菌为同时表达7α-HSDH和7β-HSDH基因的大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物为牛磺鹅去氧胆酸。7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；两个7α-HSDH分别来源于:撒丁岛梭菌(ClostridiumsardiniensestrainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(EscherichiacolistrainTW14359,GenBank登录号：CU928163.2)，两个7β-HSDH基因分别来源于:撒丁岛梭菌(ClostridiumsardiniensestrainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(RuminococcusgnavusstrainN53,GenBank登录号：KF052988.1)，分别采用http://www.jcat.de/在线软件以大肠杆菌为宿主菌，根据密码子偏好性，对全基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。所述的由牛磺鹅去氧胆酸获取牛磺熊去氧胆酸的简便方法，其特征在于，包括如下具体步骤：a)双基因表达载体的构建①两个7α-HSDH和两个7β-HSDH的编码区(ORF)分别进行密码子优化，5’和3’段增加酶切位点，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2；②合成的四个基因分别进行双酶切并分别连接入pETM6载体的多克隆位点，使每个基因均带有独立的启动子、核糖体结合位点(RBS)和终止子元件，得pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2；③将pETM6-α1、pETM6-α2分别酶切作为载体片段；将pETM6-β1、pETM6-β2分别进行酶切，得到“启动子-RBS-β1-终止子”和“启动子-RBS-β2-终止子”的表达盒作为插入子片段；顺次连接，得到pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2。b)多基因表达载体构建将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2重组载体再次进行双酶切，作为载体片段；与③中得到的“启动子-RBS-β1-终止子”和“启动子-RBS-β2-终止子”片段进行连接，得到pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2。c)工程菌的构建①将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2分别转入大肠杆菌，得到四个带有双基因表达载体的工程菌E.coliBL21star-pETM6-α1β1、E.coliBL21star-pETM6-α1β2、E.coliBL21star-pETM6-α2β1、E.coliBL21star-pETM6-α2β2。pETM6空载体转入大肠杆菌，得到E.coliBL21star-pETM6，作为载体对照工程菌。②将pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2分别转入大肠杆菌，又得到六个带有多基因表达载体的工程菌：E.coliBL21star-pETM6-α1β1β1、E.coliBL21star-pETM6-α1β1β2、E.coliBL21star-pETM6-α1β1β2、E.coliBL21star-pETM6-α2β1β1、E.coliBL21star-pETM6-α2β1β2、E.coliBL21star-pETM6-α2β2β2。d)工程菌的培养①将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于20～40℃(优选25～37℃)活化培养1～7天(优选1～3天)；②从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于加有附加50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)LB液体培养基的三角瓶中，在75～225rpm/min(优选180～225rpm/min)、20～40℃(优选25～37℃)下震荡培养12～24小时(优选12～16小时)；③将上述培养物按1:50比例接种到液体M9培养基，在75～225rpm/min(优选180～225rpm/min)、20～40℃(优选25～37℃)下震荡培养3～5小时(优选3.5～4小时)，加入0.1～1mM(优选0.5～1mM)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，继续培养3～5小时(优选3～4小时)；e)底物发酵转化①将上述培养物离心，收集菌体，以5～20(优选12～20)倍浓缩至新的附加50～100mg/L(优选80～100mg/L)的Amp+、0.1～1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：工程菌直接发酵转化法，包括7α‑HSDH和7β‑HSDH基因密码子优化、工程菌的构建、工程菌培养、底物的转化及产物制备；所述工程菌为同时表达7α‑HSDH和7β‑HSDH基因的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物为牛磺鹅去氧胆酸。

【技术特征摘要】
1.一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：工程菌直接发酵转化法，包括7α-HSDH和7β-HSDH基因密码子优化、工程菌的构建、工程菌培养、底物的转化及产物制备；所述工程菌为同时表达7α-HSDH和7β-HSDH基因的大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物为牛磺鹅去氧胆酸。2.根据权利要求1的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；两个7α-HSDH分别来源于:撒丁岛梭菌(ClostridiumsardiniensestrainDSM599，GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(EscherichiacolistrainTW14359，GenBank登录号：CU928163.2)，两个7β-HSDH基因分别来源于:撒丁岛梭菌(ClostridiumsardiniensestrainDSM599，GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(RuminococcusgnavusstrainN53，GenBank登录号：KF052988.1)，分别采用http://www.jcat.de/在线软件以大肠杆菌为宿主菌，根据密码子偏好性，对全基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。3.根据权利要求1的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：，包括如下具体步骤：a)双基因表达载体构建①两个7α-HSDH和两个7β-HSDH分别进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2；②合成的四个基因各自双酶切并分别连接入pETM6载体，得pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2；③将pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2分别进行酶切连接，得到pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2。b)多基因表达载体构建在pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2重组载体的基础上，分别酶切重组载体和pETM6-β1、pETM6-β2，再次连接β基因，得到pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2；c)工程菌的构建①将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2分别转入大肠杆菌BL21star感受态细胞，得到四个带有双基因表达载体的工程菌E.coliBL21star-pETM6-α1β1、E.coliBL21star-pETM6-α1β2、E.coliBL21star-pETM6-α2β1、E.coliBL21star-pETM6-α2β2；pETM6空载体转入大肠杆菌，得到E.coliBL21star-pETM6，作为载体对照工程菌；②将pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、p...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵淑娟，王峥涛，杨莉，史杰，周吉燕，胡之璧，张金家，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：上海,31