柱层析分离法提取羊胆汁中牛磺胆酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种柱层析分离法提取羊胆汁中牛磺胆酸的方法，包括过滤、蛋白沉淀处理、除色素处理、盐析、萃取、脱水浓缩和柱层析分离等步骤。本发明专利技术以羊胆汁作为提取原料，不仅降低了牛磺胆酸的提取成本，而且提取工艺更为简单，收益更高。本发明专利技术以柱层析分离法提取牛磺胆酸，柱层析分离纯化效果好，提取的牛磺胆酸精品无腥味、纯度高，且产品收率高，提取工艺简单，利于工业化大生产。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，包括过滤、蛋白沉淀处理、除色素处理、盐析、萃取、脱水浓缩和柱层析分离等步骤。本专利技术以羊胆汁作为提取原料，不仅降低了牛磺胆酸的提取成本，而且提取工艺更为简单，收益更高。本专利技术以柱层析分离法提取牛磺胆酸，柱层析分离纯化效果好，提取的牛磺胆酸精品无腥味、纯度高，且产品收率高，提取工艺简单，利于工业化大生产。【专利说明】
本专利技术属于生物医药
，涉及牛磺胆酸的提取方法，具体涉及。
技术介绍
胆汁酸是药用胆汁中的主要成分，是各种胆酸类的总称。各种胆酸类在肝中与甘氨酸或牛磺酸结合，并以钠盐的形式分泌到胆中。甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠作为胆盐的主要成分，在体内与脂肪的消化和吸收有重要的关系，其不但能增强脂肪酶的活性，催化脂肪分解，增加脂溶性维生素的吸收，还能促进胆汁的分泌，刺激小肠运动。牛磺胆酸广泛存在于牛、羊、蛇、兔等动物的胆汁中，是由胆酸和牛磺酸结合形成的一种结合型胆汁酸。牛磺胆酸具有利胆、杀菌、抗炎、镇咳、祛痰、平喘的作用，可以降血压、降低心脏收缩幅度及频率等多种药理作用，是非常具有开发应用前景的药物。目前，牛磺胆酸主要是从牛的胆汁中提取，而牛的胆汁来源较为困难。同时，由于牛的胆汁与羊的胆汁成分有一定的差异，如蛋白质等杂质含量不同，当常规的牛胆汁提取方法在用于从羊胆汁中提取牛磺胆酸时，不仅提取率低下，而且产品中杂质含量高，因此，需要一种适用于从羊胆汁中提取牛磺胆酸的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种，该提取方法原料来源广泛、提取工艺简单、产品纯度高。为解决上述技术问题，本专利技术釆取的技术方案如下: ，包括如下步骤: (O过滤:取新鲜羊胆汁于双层沙布内静置过滤24~48小时，收集滤液； (2)蛋白沉淀处理:于步骤(1)的滤液中加入2~4倍体积量的蛋白沉淀剂，搅拌后以10000~20000rpm/min、4~10°C离心30~60分钟,收集得到黄绿色上清液； (3)除色素处理:于步骤(2)的上清液中加入10~20g/100ml活性碳，30~50°C加热10~30分钟，冷却后以10000~20000rpm/min、4~10°C离心30~60分钟，收集得到无色上清液； (4)浓缩:将步骤(3)的上清液于旋转蒸发仪浓缩10~20倍；(5)盐析:于步骤(4)的浓缩液体中加入10~50倍体积量的水，使用酸调节pH值为6.0~7.0，加入氯化钠至搅拌出现白色沉淀物，于4~10°C放置过夜； (6)萃取:用体积比为(4~10`):(1:3)氯仿:乙醇的混合液溶解步骤(5)的沉淀物，用分液漏斗萃取2~5次，蒸馏回收混合液的，得到粘稠液体；(7)脱水浓缩:将步骤(6)的粘稠液体用无水硫酸钠过滤除去其中水分，得到牛磺胆酸粗品; (8)柱层析分离:将上述牛磺胆酸粗品加入硅胶层析柱上，用体积比为2~4:0.5~1:2~4的氯仿、异丙醇和乙醇作为流动相洗脱，收集460 nm处有吸收值的液体，置于旋转蒸发仪中浓缩回收流动相，收集所得白色结晶冷冻保存，即为牛磺胆酸的纯品。作为本专利技术的改进，上述步骤(2)使用的蛋白沉淀剂为甲醇、乙醇和乙腈的一种或两种组成的混合溶剂。上述步骤(2)使用的蛋白沉淀剂进一步优选为乙腈。作为本专利技术进一步的改进，上述步骤(5)使用的酸为盐酸、硫酸或磷酸等无机酸。上述步骤(5)使用的酸进一步优选为盐酸。作为本专利技术更一步的改进，上述步骤(6)中氯仿与乙醇的体积比为4:1。作为本专利技术更一步的改进，上述步骤(8)的流动相为体积比为3:1:2的氯仿、异丙醇和乙醇组成的混合溶液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为: 1、本专利技术以羊胆汁作为提取原料，羊胆汁原料广泛易得，羊胆汁较牛胆汁价格便宜，不仅降低了牛磺胆酸的提取成本，而且由于羊胆汁中杂质含量少，羊胆汁中的牛磺酸结合物比例高于牛胆汁，因此从羊胆汁提取牛磺胆酸，工艺更为简单，收益更高。2、本专利技术以柱层析分离法提取牛磺胆酸，羊胆汁经过沉淀、盐析和萃取步骤可除去大量蛋白质等杂质，减轻了柱层析分离时的阻力，缩短了工艺周期，柱层析分离纯化效果好，提取的牛磺胆酸精品无腥味、纯度高，且产品收率高，提取工艺简单，利于工业化大生产。 【具体实施方式】为便于理解本专利技术，本专利技术列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本专利技术，不应视为对本专利技术的具体限制。下列实施例中，所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。其中，所述“浓缩”是指将溶剂从体系中移除以增大溶质的浓度的过程，包括但不限于常压浓缩、减压浓缩等。实施例1 ，包括如下步骤: (1)过滤:取新鲜羊胆汁于双层沙布内静置过滤48小时，收集滤液； (2)蛋白沉淀处理:于步骤(1)的 滤液中加入3倍体积量的乙醇，搅拌后以15000rpm/min、8°C离心30分钟，收集得到黄绿色上清液； (3)除色素处理:于步骤(2)的上清液中加入10g/100ml活性碳，40°C加热20分钟，冷却后以15000rpm/min、8°C离心45分钟，收集得到无色上清液； (4)浓缩:将步骤(3)的上清液于旋转蒸发仪浓缩15倍； (5)盐析:于步骤(4)的浓缩液体中加入30倍体积量的水，使用盐酸调节pH值为6.5，加入氯化钠至搅拌出现白色沉淀物，于8°C放置过夜； (6)萃取:用体积比为4:1氯仿:乙醇的混合液溶解步骤(5)的沉淀物，用分液漏斗萃取3次，蒸馏回收混合液的，得到粘稠液体；(7)脱水浓缩:将步骤(6)的粘稠液体用无水硫酸钠过滤除去其中水分，得到牛磺胆酸粗品； (8)柱层析分离:将上述牛磺胆酸粗品加入硅胶层析柱(长60cm、内径6 cm，固定相为硅胶G)上，线速度为IOml/分钟，用体积比为3:1:2的氯仿、异丙醇和乙醇作为流动相洗脱，收集460 nm处有吸收值的液体，置于旋转蒸发仪中浓缩回收流动相，收集所得白色结晶冷冻保存，即为牛磺胆酸的纯品。含量测定如下: 以收集的牛磺胆酸液为样品，牛磺胆酸标准品为对照，于薄层层析板上点样定量分析，展开剂为氯仿:正丁醇:乙酸:水=30:30:4:1，显色剂为浓度20%硫酸，将显色后薄层层析板放入CS-930双波长薄层扫描仪进行检测，扫描波长λ = 460，用峰面积计算含量，各进行3次，取均值，经计算提取的牛磺胆酸的纯度为97.0%。提取率的测定如下: 分3次采集羊胆汁，将提取的牛磺胆酸称重，计算每100 mL胆汁中提取的牛磺胆酸量，最后取均值计算平均提取率，经计算每100ml羊胆汁可提取牛磺胆酸1.0lgo实施例2 ，包括如下步骤: (1)过滤:取新鲜羊胆汁于双层沙布内静置过滤48小时，收集滤液； (2)蛋白沉淀处理:于步骤(1)的滤液中加入3倍体积量的乙腈，搅拌后以15000rpm/min、8°C离心30分钟，收集得到黄绿色上清液； (3)除色素处理:于步骤(2)的上清液中加入10g/100ml活性碳，40°C加热20分钟，冷却后以15000rpm/min、8°C离心45分钟，收集得到无色上清液； (4)浓缩:将步骤(3)的上清液于旋转蒸发仪浓缩15倍； (5)盐析:于步骤(4)的浓缩液体中加入30倍体积量的水，使用盐酸调节pH值为6.5，加入氯化钠至搅拌出本文档来自技高网...

【技术保护点】
柱层析分离法提取羊胆汁中牛磺胆酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）过滤：取新鲜羊胆汁于双层沙布内静置过滤24～48小时，收集滤液；（2）蛋白沉淀处理：于步骤（1）的滤液中加入2～4倍体积量的蛋白沉淀剂，搅拌后以10000～20000rpm/min、4～10℃离心30～60分钟，收集得到黄绿色上清液；（3）除色素处理：于步骤（2）的上清液中加入10～20g/100ml活性碳，30～50℃加热10～30分钟，冷却后以10000～20000rpm/min、4～10℃离心30～60分钟，收集得到无色上清液；（4）浓缩：将步骤（3）的上清液于旋转蒸发仪浓缩10～20倍；（5）盐析：于步骤（4）的浓缩液体中加入10～50倍体积量的水，使用酸调节pH值为6.0～7.0，加入氯化钠至搅拌出现白色沉淀物，于4～10℃放置过夜；（6）萃取：用体积比为（4～10）：（1：3）氯仿：乙醇的混合液溶解步骤（5）的沉淀物，用分液漏斗萃取2～5次，蒸馏回收混合液的，得到粘稠液体；（7）脱水浓缩：将步骤（6）的粘稠液体用无水硫酸钠过滤除去其中水分，得到牛磺胆酸粗品；（8）柱层析分离：将上述牛磺胆酸粗品加入硅胶层析柱上，用体积比为2～4：0.5～1：2～4的氯仿、异丙醇和乙醇作为流动相洗脱，收集460?nm处有吸收值的液体，置于旋转蒸发仪中浓缩回收流动相，收集所得白色结晶冷冻保存，即为牛磺胆酸的纯品。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孔艳飞，
申请(专利权)人：淮北市恒通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：