马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法技术

本发明专利技术公开了一种马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，通过采用酶解法、界面法分离和纯化马铃薯原生质体，聚乙二醇(PEG)诱导融合法融合四倍体和二倍体原生质体，摸索、优化获得了一套最优的针对参试马铃薯原生质体分离纯化条件、原生质体培养基、愈伤组织再生培养基、四倍体与二倍体原生质体融合方法。并在使用该方法进行的费乌瑞它和野生二倍体材料(E12、E25)融合实验中，得到经DNA进行SRAP分子标记检测的融合株系2个和融合愈伤组织4个；这些材料可作为后续实验材料使用，以确定所获得的融合株系在农艺性状的变化及在生产上的可能应用。

Protoplast fusion method between tetraploid and diploid wild potato species

The invention discloses a potato tetraploid cultivar and wild diploid species by protoplast fusion method, separation and purification of potato protoplasts by enzymatic method, interface method, polyethylene glycol (PEG) fusion method to fusion of tetraploid and diploid protoplast induction, exploration and optimization to get a set of optimal for tested potato protoplast isolation and purification the conditions of protoplast culture medium, callus regeneration medium, tetraploid and diploid protoplast fusion method. And in the use of the method of Feiwuruita and wild diploid materials (E12, E25) fusion experiment, obtained by DNA strain fusion of SRAP molecular markers and 2 fusion calli 4; these materials can be used as the experimental materials, to determine the strain variation in agronomic fusion the characteristics and possible application in production.

【技术实现步骤摘要】
马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法
本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法。
技术介绍
马铃薯是多倍体植物，不同倍性种质资源在自然界中大量存在，其中马铃薯普通栽培种是高度杂合，无性繁殖的同源四倍体作物。二倍体种主要有原始栽培种和野生种，是马铃薯抗病、抗虫、耐不良环境、低还原糖含量等性状的重要基因库。生产上应用马铃薯四倍体普通栽培种具有遗传背景狭窄，抗性基因库贫乏，亲缘关系近的特点。通过对二倍体野生种与四倍体栽培种马铃薯农艺性状、生理和叶片蛋白质组综合比较，揭示二倍体野生种与四倍体栽培种抗性，品质，发育和代谢调控上的差异和机制，为马铃薯种质资源的利用奠定理论和实践基础。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，包括如下步骤：S1、选择光照充足条件下培养2-3周的马铃薯组培苗叶片，在无菌条件下，将马铃薯组培苗叶片切划后，叶片正面朝下浸于酶解液内，26℃暗条件静置温育16-18h；酶解消化结束后，轻轻晃动培养皿，使原生质体从已酶解消化的叶片中释放到酶解液中；100目尼龙过滤网过滤后，将包含原生质体的酶解液转入无菌离心管中进行分离纯化，得待融合的马铃薯原生质体；S2、将所得的马铃薯原生质体分别漂洗后，再用漂洗液重悬并调整稀释至3.5×104个/ml后(采用血球计数板法计数后换算稀释)，将两种原生质体等体积混合均匀；然后用移液器取等分量的800ul分别移至直径5cm的培养皿中，并静置5-10min；使原生质体粘附在培养皿底部；S3、用移液器吸取PEG溶液，并滴加4-5滴到原生质体混合液上，确保PEG都覆盖粘附在底部原生质体；静置温育10-15min(不同品种马铃薯有一定的差异)，随后，将培养皿倾斜45度，此时，原生质体依然粘附在培养皿底部，而PEG混合液流往皿边，再用移液器吸取PEG混合液干净；S4、用漂洗液漂洗粘附在培养皿底部的融合原生质体，倾斜培养皿后去除漂洗液；重复漂洗一次；S5、往培养皿中轻轻加入5ml改良KM培养基，用parafilm封口胶密封好培养皿；并置26℃条件下暗培养7天，随后转到光照12h/天培养箱中静置培养；S6、培养20天后，用稀释培养基稀释10倍后，转移到直径9-10cm的培养皿中继续培养，培养条件为光照12h/天，26℃的培养箱；S7、培养4-5周后，把生成的单个愈伤组织转接到愈伤组织再生培养基中，大约5周后，愈伤会可能分化形成新植株。优选地，所述酶解液为JapanYakult的0.5％纤维素酶R-10和0.5％离析酶R-10的CPW酶解液，二倍体和四倍体分别酶解16h和18h。优选地，所述步骤S1通过以下步骤完成分离纯化：S11、离心含原生质体的酶解液500rpm，5min；弃上清液后，用23％(W/V)的蔗糖溶液重悬原生质体，再500rpm离心5min，弃上清；S12、用含0.5mM甘露醇和0.5mMCaCl2的漂洗液重悬原生质体，再500rpm离心5min收集原生质体，弃上清；重复以上漂洗液重悬、清洗、收集原生质体2次。优选地，所述步骤S5中改良KM培养基为0.75mg/lZeatin+0.1mg/l2，4-D+1.0mg/lNAA。优选地，所述步骤S6中稀释培养基为0.1mg/l2，4-D+2.0mg/l6-BA。优选地，所述步骤S7中的愈伤组织再生培养基为0.2mg/lZeatin+2.0mg/lIAA。本专利技术具有以下有益效果：通过采用酶解法、界面法分离和纯化马铃薯原生质体，聚乙二醇(PEG)诱导融合法融合四倍体和二倍体原生质体，摸索、优化获得了一套最优的针对参试马铃薯原生质体分离纯化条件、原生质体培养基、愈伤组织再生培养基、四倍体与二倍体原生质体融合方法。并在使用该方法进行的费乌瑞它和野生二倍体材料(E12、E25)融合实验中，得到经DNA进行SRAP分子标记检测的融合株系2个和融合愈伤组织4个；这些材料可作为后续实验材料使用，以确定所获得的融合株系在农艺性状的变化及在生产上的可能应用。具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例以“费乌瑞它”和E25-2为材料，进行原生质体分离、纯化条件的摸索、优化，得到如下结果：1)外植体选择实验材料包括费乌瑞它组培试管苗和大田、温室植株幼嫩叶片。实验方法为试管苗直接无菌操作使用，大田、温室植株幼嫩叶片经过6％NaClO溶液消毒10min或0.1％HgCl2消毒5min；结果表明：大田、温室植株幼嫩叶片材料来源方便，但消毒麻烦、不彻底或者消毒过量，时间不易控制，后续培养变数大；同时，嫩叶在经过消毒后，容易褐化，这在随后的酶解中很容易看到；而试管苗可以避免这些问题。但是以试管苗为材料需要量大，需要大量扩繁。经过实验比较，实验中选择使用试管苗作为原生质体来源材料。2)酶解液选择本专利技术选择纤维素酶R-10和离析酶R-10两种酶作为解离酶，选择S培养基和CPW溶液作为酶的溶解液，进行酶解效果实验。以下实验均以单位时间内酶解出游离原生质体数量(数值越大越好，单位为104个/ml)和组织碎片量(“+”越少越好)来判断酶解效果。表1.实验所用的两种酶制剂的溶解液经过4种酶解液的对比实验，确定酶解液I为马铃薯原生质体分离酶解液。表2.实验所用的四种酶解液经过实验比较，结果表明：不同公司生产、分装或者同公司生的不同批次的酶酶解效果都有差异。综合考虑，采用Solabio公司分装JapanYakult的0.5％纤维素酶R-10和0.5％离析酶R-10作为酶解液，亦即酶解液l，溶解液为CPW。3)酶解时间优化根据不同实验材料(二倍体及四倍体)及相同材料的不同取样部分(叶片、叶柄及茎)优化最佳的酶解时间。表3.不同材料及酶解时间的酶解效果(0.5-0.5)(单位：104个/ml)结果表明：费乌瑞它选择叶片酶解酶解18h，原生质体数量最多，碎片比较少，故取18h；二倍体材料酶解16h效果最佳，虽然酶解18h原生质体数量更多，但碎片也极多，故，取16h。4)原生质体分离、纯化和培养实验设计3种分离液，主要成分是Ficoll或蔗糖，分离液的溶解液根据酶解液选择，与酶解液同步(CPW)，结果见表4。表4.原生质体分离及纯化所使用的分离液表5.离心转速及分离效果分离时，如果离心转速过大，时间过长，部分原生质体会随组织碎片被沉淀到离心管底；离心转速过小，时间过短，则组织碎片还留在原生质体层，分离不干净，达不到分离纯化的作用。因此，经过综合对比效果及成本，我们选择分离液III作为原生质体分离的分离液；离心转速为500rpm，离心时间为5min(表5)。分离纯化得到马铃薯的原生质体后，利用溶解液(CPW)洗涤、离心3次，然后利用血球计数板在显微镜下观察，测定原生质体浓度，用改良KM培养基稀释成106个/ml浓度的原生质体液进行25℃暗培养。培养按静止和80rpm振荡进行对比培养。3.原生质体培养条件优化培养条件优化是原生质体培养的关键步骤，通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、选择光照充足条件下培养2‑3周的马铃薯组培苗叶片，在无菌条件下，将马铃薯组培苗叶片切划后，叶片正面朝下浸于酶解液内，26℃暗条件静置温育16‑18h；酶解消化结束后，轻轻晃动培养皿，使原生质体从已酶解消化的叶片中释放到酶解液中；100目尼龙过滤网过滤后，将包含原生质体的酶解液转入无菌离心管中进行分离纯化，得待融合的马铃薯原生质体；S2、将所得的马铃薯原生质体分别漂洗后，再用漂洗液重悬并调整稀释至33.5×10

【技术特征摘要】
1.马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、选择光照充足条件下培养2-3周的马铃薯组培苗叶片，在无菌条件下，将马铃薯组培苗叶片切划后，叶片正面朝下浸于酶解液内，26℃暗条件静置温育16-18h；酶解消化结束后，轻轻晃动培养皿，使原生质体从已酶解消化的叶片中释放到酶解液中；100目尼龙过滤网过滤后，将包含原生质体的酶解液转入无菌离心管中进行分离纯化，得待融合的马铃薯原生质体；S2、将所得的马铃薯原生质体分别漂洗后，再用漂洗液重悬并调整稀释至33.5×104个/ml后，将两种原生质体等体积混合均匀；然后用移液器取等分量的800ul分别移至直径5cm的培养皿中，并静置5-10min；使原生质体粘附在培养皿底部；S3、用移液器吸取PEG溶液，并滴加4-5滴到原生质体混合液上，确保PEG都覆盖粘附在底部原生质体；静置温育10-15min，随后，将培养皿倾斜45度，此时，原生质体依然粘附在培养皿底部，而PEG混合液流往皿边，再用移液器吸取PEG混合液干净；S4、用漂洗液漂洗粘附在培养皿底部的融合原生质体，倾斜培养皿后去除漂洗液；重复漂洗一次；S5、往培养皿中轻轻加入5ml改良KM培养基，用parafilm封口胶密封好培养皿；并置26℃条件下暗培养7天，随后转到光照12h/天培养箱中静置培养；S6、培养20天后，用稀释培养基稀释10倍后，转移到直径9-10cm的培养皿中继续培养，培养条件为光照12h/天，26℃的培养箱；S7、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李正丽，陶莲，邓英，张丽，唐兵，赵夏云，马关鹏，
申请(专利权)人：贵州省园艺研究所，
类型：发明
国别省市：贵州,52