一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其解决了现有菌株多氧霉素I组分含量较低的技术问题，本发明专利技术的出发菌株为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)，该方法包括配制出发菌株孢子悬液，将稀释后的孢子悬液经过紫外诱变后，涂布于含有5‑氟尿嘧啶抗性平板，培养后，对抗性菌株筛选得到多氧霉素I组分高产菌株。本发明专利技术筛选的多氧霉素I组分(polyoxin I)高产菌株，其发酵液对烟草赤星菌具有抑制作用。本发明专利技术的筛选方法可以快速地筛选出高产菌株。

Screening method of a high producing strain of I component of lincomycin

The invention relates to a polyoxin I screening method group yield strain and the strain of polyoxin I group were with lower technical problems, the strain of the invention is Streptomyces ansochromogenes (Streptomyces ansochromogenes), the method includes preparing strain spore suspension that will be diluted spore suspension after UV mutagenesis, containing 5 fluorouracil resistant coating on the plate, after culture, the resistant strains were screened polyoxin I component high yield strains. The present invention polyoxin screening I component (polyoxin I) high yield strains, the fermentation liquid has inhibition effects on Alternaria alternata. The screening method of the invention can rapidly screen high-yield strains.

【技术实现步骤摘要】
一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法
本专利技术涉及生物工程
，具体地说是一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法。
技术介绍
随着近代生物学技术的不断进步，相关的农业生产拥有了更加广阔的发展前景，同时快速发展的农业生产对相应的高产高效抗生素药物的需求量也日益增加。多氧霉素(polyoxin)是一种重要的核苷肽类抗生素，由于它的结构与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺相似，因此它能够竞争性地抑制几丁质的合成，从而抑制真菌的生长。多氧霉素是一种高效、低毒、无环境污染的安全农药，在农业生产中应用广泛，对稻瘟病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病和白粉病、烟草赤星病、蔬菜白粉病、菌核病等真菌性植物病害有良好防治作用。在微生物菌种选育过程中，诱变育种是主要方法之一。它利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞群，促进其在非自然条件下随机突变频率大幅度提高，然后用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株(高产株或有效组分高产株)。多氧霉素(polyoxin)是含有A～N14种不同同系物的混合物，各主要组份的作用又不相同，其中多氧霉素I组分(polyoxinI)对烟草赤星菌具有抑制作用，但是polyoxinI在多氧霉素中的含量较低，因此要提高多氧霉素对烟草赤星菌的抗菌作用，必须提高polyoxinI的含量，目前还没有相关技术公开。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决现有菌株多氧霉素I组分含量较低的技术问题，提供一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，通过诱变育种筛选得到多氧霉素I组分高产菌株。为此，本专利技术提供一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其包括以下步骤：步骤1、将多氧霉素出发菌株圈卷产色链霉菌野生型P0接种于斜面培养基恒温培养，所述斜面培养基包括以下成份，单位为g/L：可溶性淀粉：15～25；KNO3：0.8～1.2；K2HPO4：0.3～0.8；MgSO4·7H2O：0.3～0.8；NaCl：0.3～0.8；FeSO4·7H2O：0.008～0.012；琼脂：15～25；步骤2、挑选步骤1培养的孢子，并加入生理盐水，制成孢子悬液；步骤3、按步骤1所述培养基配制不同浓度的5-氟尿嘧啶的孢子培养基，5-氟尿嘧啶浓度，分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1，单位为g/L；步骤4、将步骤1所述的野生型菌株P0作为出发菌株，分别涂布于步骤3所述的不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；步骤5、根据步骤4所述的孢子生长情况，选择3种不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，其浓度分别为0.1、0.3、1，单位为g/L；步骤6、将步骤2所述的孢子悬液稀释，取3～5mL稀释后的孢子悬液置于无菌平板中，放置于紫外诱变箱中进行照射；步骤7、将步骤6所述的无菌平板取出，将其上的孢子悬液稀释，并分别涂布于步骤5所述的3种不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；步骤8、挑选步骤7培养的突变后的单菌落，接种于步骤1所述的斜面培养基，恒温培养；步骤9、将步骤8培养的菌落接种到种子培养基，恒温培养，所述种子培养基包括以下成份，单位为g/L：酵母提取物：8～12；胰蛋白胨：12～18；KNO3：0.8～1.2；K2HPO4：0.3～0.8；MgSO4·7H2O：0.3～0.8；NaCl：0.3～0.8；FeSO4·7H2O：0.008～0.012；步骤10、将步骤9培养的菌落按菌落与发酵培养基体积百分比8～12％的接种量接种到发酵培养基进行摇瓶发酵，同时以步骤4所述的出发菌株做对照，所述发酵培养基包括以下成份，单位为g/L：淀粉：40～60；豆粕粉：20～28；酵母提取物：3～8；甘露醇：3～8；NaCl：3～8；NH4SO4：0.3～0.8；CaCO3：1～5；步骤11、对步骤10的发酵产物中多氧霉素组分变化进行检测，筛选与出发菌株P0次级代谢组分有差异的菌株；步骤12、对步骤11筛选的菌株进行检测，筛选出多氧霉素I组分高产菌株。优选的，步骤1斜面培养基包括以下成份，单位为g/L：可溶性淀粉：20；KNO3：1；K2HPO4：0.5；MgSO4·7H2O：0.5；NaCl：0.5；FeSO4·7H2O：0.01；琼脂：20；所述斜面培养基的pH值为7.0。优选的，步骤9中，种子培养基包括以下成份，单位g/L：酵母提取物：10；胰蛋白胨：16；KNO3：1；K2HPO4：0.5；MgSO4·7H2O：0.5；NaCl：0.5；FeSO4·7H2O：0.01；所述种子培养基的pH值为7.0。优选的，步骤10中，发酵培养基包括以下成份，单位为g/L：淀粉：50；豆粕粉：25；酵母提取物：5；甘露醇：5；NaCl：5；NH4SO4：0.5；CaCO3：2；所述发酵培养基的pH值为7.1。优选的，步骤6中紫外诱变，紫外光的波长为253.5nm，紫外灯的功率为15W，紫外诱变箱与无菌平板的垂直距离为30cm，紫外光照射时间为5～10s。优选的，步骤1的培养为在温度29℃的条件下培养5～7天。优选的，步骤7的培养为温度28℃暗处培养10～14天。优选的，步骤8的培养为温度28℃培养7天；所述步骤9所述的培养为在29℃、转速250rpm恒温摇床培养20～36h。优选的，步骤10的培养为在29℃、转速250rpm恒温摇床培养3～7天。本专利技术同时提供一种多氧霉素I组分高产菌株的应用，所述多氧霉素I组分高产菌株发酵液对烟草赤星菌具有抑菌作用。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法及其应用，筛选得到多氧霉素I组分高产菌株的发酵液主要成分为多氧霉素I组分，其发酵液对烟草赤星菌具有抑菌作用。本专利技术的筛选方法可以理性快速地筛选高产菌株，简单易行，所涉及的培养基原料成本低、来源广，具有十分重要的工农业应用潜力。附图说明图1为出发菌株P0发酵液HPLC分析图谱。图2为多氧霉素I组分(polyoxinI)高产菌株发酵液HPLC分析图谱。图3为出发菌株P0发酵液HPLC-HRMS分析图谱。图4为多氧霉素I组分(polyoxinI)高产菌株发酵液HPLC-HRMS分析图谱。图5为多氧霉素I组分(polyoxinI)高产菌株发酵液对烟草赤星菌的抗菌活性实验。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本专利技术。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1：原始菌株P0孢子制备。1、取多氧霉素出发菌株圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)野生型P0(该菌种购自于中国科学院成都生物研究所)接种于斜面培养基。在温度29℃的条件下培养7天，挑选斜面培养基上的孢子，加入生理盐水，制成孢子悬液。斜面培养基(100ml)，按质量体积比计，其成分为：可溶性淀粉：2g；KNO3：0.1g；K2HPO4：0.05g；MgSO4·7H2O：0.05g；NaCl：0.05g；FeSO4·7H2O：0.001g；琼脂：2g；调节培养基的pH值至7.0。2、用野生型菌株P0作为出发菌株。首先，确定5氟尿嘧啶对P0菌株的最低抑菌浓度。配制含有不同浓度5-氟尿嘧啶的孢子培养基(5-氟尿嘧啶浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其特征是包括以下步骤：步骤1、将多氧霉素出发菌株圈卷产色链霉菌野生型P0接种于斜面培养基恒温培养，所述斜面培养基包括以下成份，单位为g/L：可溶性淀粉：15～25；KNO3：0.8～1.2；K2HPO4：0.3～0.8；MgSO4·7H2O：0.3～0.8；NaCl：0.3～0.8；FeSO4·7H2O：0.008～0.012；琼脂：15～25；步骤2、挑选步骤1培养的孢子，并加入生理盐水，制成孢子悬液；步骤3、按步骤1所述培养基配制不同浓度的5‑氟尿嘧啶的孢子培养基，5‑氟尿嘧啶浓度，分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1，单位为g/L；步骤4、将步骤1所述的野生型菌株P0作为出发菌株，分别涂布于步骤3所述的不同浓度的5‑氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；步骤5、根据步骤4所述的孢子生长情况，选择3种不同浓度的5‑氟尿嘧啶孢子培养基，其浓度分别为0.1、0.3、1，单位为g/L；步骤6、将步骤2所述的孢子悬液稀释，取3～5mL稀释后的孢子悬液置于无菌平板中，放置于紫外诱变箱中进行照射；步骤7、将步骤6所述的无菌平板取出，将其上的孢子悬液稀释，并分别涂布于步骤5所述的3种不同浓度的5‑氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；步骤8、挑选步骤7培养的突变后的单菌落，接种于步骤1所述的斜面培养基，恒温培养；步骤9、将步骤8培养的菌落接种到种子培养基，恒温培养，所述种子培养基包括以下成份，单位为g/L：酵母提取物：8～12；胰蛋白胨：12～18；KNO3：0.8～1.2；K2HPO4：0.3～0.8；MgSO4·7H2O：0.3～0.8；NaCl：0.3～0.8；FeSO4·7H2O：0.008～0.012；步骤10、将步骤9培养的菌落按菌落与发酵培养基体积百分比8～12％的接种量接种到发酵培养基进行摇瓶发酵，同时以步骤4所述的出发菌株做对照，所述发酵培养基包括以下成份，单位为g/L：淀粉：40～60；豆粕粉：20～28；酵母提取物：3～8；甘露醇：3～8；NaCl：3～8；NH4SO4：0.3～0.8；CaCO3：1～5；步骤11、对步骤10的发酵产物中多氧霉素组分变化进行检测，筛选与出发菌株P0次级代谢组分有差异的菌株；步骤12、对步骤11筛选的菌株进行检测，筛选出多氧霉素I组分高产菌株。...

【技术特征摘要】
1.一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法，其特征是包括以下步骤：步骤1、将多氧霉素出发菌株圈卷产色链霉菌野生型P0接种于斜面培养基恒温培养，所述斜面培养基包括以下成份，单位为g/L：可溶性淀粉：15～25；KNO3：0.8～1.2；K2HPO4：0.3～0.8；MgSO4·7H2O：0.3～0.8；NaCl：0.3～0.8；FeSO4·7H2O：0.008～0.012；琼脂：15～25；步骤2、挑选步骤1培养的孢子，并加入生理盐水，制成孢子悬液；步骤3、按步骤1所述培养基配制不同浓度的5-氟尿嘧啶的孢子培养基，5-氟尿嘧啶浓度，分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1，单位为g/L；步骤4、将步骤1所述的野生型菌株P0作为出发菌株，分别涂布于步骤3所述的不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；步骤5、根据步骤4所述的孢子生长情况，选择3种不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，其浓度分别为0.1、0.3、1，单位为g/L；步骤6、将步骤2所述的孢子悬液稀释，取3～5mL稀释后的孢子悬液置于无菌平板中，放置于紫外诱变箱中进行照射；步骤7、将步骤6所述的无菌平板取出，将其上的孢子悬液稀释，并分别涂布于步骤5所述的3种不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；步骤8、挑选步骤7培养的突变后的单菌落，接种于步骤1所述的斜面培养基，恒温培养；步骤9、将步骤8培养的菌落接种到种子培养基，恒温培养，所述种子培养基包括以下成份，单位为g/L：酵母提取物：8～12；胰蛋白胨：12～18；KNO3：0.8～1.2；K2HPO4：0.3～0.8；MgSO4·7H2O：0.3～0.8；NaCl：0.3～0.8；FeSO4·7H2O：0.008～0.012；步骤10、将步骤9培养的菌落按菌落与发酵培养基体积百分比8～12％的接种量接种到发酵培养基进行摇瓶发酵，同时以步骤4所述的出发菌株做对照，所述发酵培养基包括以下成份，单位为g/L：淀粉：40～60；豆粕粉：20～28；酵母提取物：3～8；甘露醇：3～8；NaCl：3～8；NH4SO4：0.3～0.8；CaCO...

【专利技术属性】
技术研发人员：李盛英，杜磊，马圆圆，徐晓庆，王玉亭，
申请(专利权)人：乳山韩威生物科技有限公司，青岛中科青石生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37