利用生物效价检测与HPLC快速检测多抗霉素B的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用烟草赤星病菌作为生物效价检测的指示菌，结合HPLC化学检测方法，快速定量检测样品中多抗霉素B的含量。检测方法在于利用自制木盘作为检测工具，检测样品的数量为传统方法的9倍，每个检测玻璃木盘中对应相应的标准曲线，可快速准确的筛选生物效价高的样品，将筛选的高含量样品采用HPLC检测化学含量，降低生产成本，降低劳动强度，可用于对多抗霉素B菌种的高通量筛选和生产过程中的监控。

Rapid Detection of Polyantimycin B by Biotiter Detection and High Performance Liquid Chromatography

The invention relates to a rapid quantitative detection of polyantimycin B in samples by using tobacco brown spot fungus as an indicator of biological titer detection combined with the chemical detection method of high performance liquid chromatography. The detection method is to use self-made wooden tray as a detection tool. The number of samples is 9 times that of the traditional method. The corresponding standard curve in each detection glass tray can quickly and accurately screen samples with high bioavailability. The high-content samples screened can be detected by HPLC to reduce production costs and labor intensity. It can be used for high resistance to polyantimycin B strains. Flux screening and monitoring during production.

【技术实现步骤摘要】
利用生物效价检测与HPLC快速检测多抗霉素B的方法
本专利技术涉及一种药物
的检测方法，具体的涉及到多抗霉素B的生物学效价的检测和HPLC化学含量的检测。
技术介绍
多抗霉素是由金色链霉菌，经过发酵产生的代谢产物，属于广谱性抗生素杀菌剂，是由A-N14种不同组分的同系物和异构体组成，为肽嘧啶核苷类抗菌素，主要用于防治苹果落叶斑点病，人参黑斑病，水稻纹枯病等病害。目前多抗霉素B的检测方法，主要是HPLC检测法，进行化学分析计量，但是HPLC方法检测费用昂贵，流动消耗大且毒性强，而前期处理步骤过程复杂，分析时间长，不仅于大规模的菌种筛选和生产动态监控中使用，并且色谱柱容易受到发酵杂质的污染，使用寿命短，价格昂贵。抗生素的生物活性的另一个衡量标准是以生物效价检测法，该方法用量少，灵敏度高。杯碟杯法是琼脂扩散法中的一种常见的分析方法，其原理：①利用抗生素在摊布含有特定指示菌的琼脂培养基内，滴加液体可进行球型立体扩散的特征；②形成一定浓度的含有抗生素的肉眼可观察到的透明抑制圈，抑制了试验菌的繁殖；③抗生素的浓度不同，抑菌大小也不同，比较供试样品与标准品的抑菌直径，可得供试样品的含量，传统的生物测定一般采用常规的90mm、120m的培养皿，在检测时制备平板比较多，工作量大，并且每个平板最多能放6个牛津杯，并且在绘制标准曲线时由于标准溶液分别滴在不同培养皿中，存在较大的误差，因此，建立一套直观、准确快速、简单的生物效价检测方法成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用生物活性检测法，利用自制装置快速的定量分析多抗霉素的生物效价。在利用HPLC检测方法分析生物效价中含量高的样品，测得化学含量，有利于在高产菌株筛选及阶段发酵的监控，二者结合，能够二者结合的办法快速、有效、准确测定多抗霉素的有效含量，操作方便，节省成本。本专利技术的技术方案是：1.确认生物效价所用指示菌：利用烟草赤星病菌作为指示菌，生长速度快，抑菌圈明显，培养时间为16-20小时，周期短，将烟草赤星菌的成熟孢子接种到事先灭菌的PDA液体培养基中，培养3-4天，得到烟草赤星病菌的成熟菌丝体；2.确定生物效价测定过程适用的工具：采用自制的木盘取代传统的90mm、120mm的培养皿，规格为长30cm*宽20cm*高4cm，底面积为600cm2，比传统的90mm、120mm培养皿大，可放40个牛津杯，可同时检测18个样品，效率是传统的9倍；3.确定生物检测的条件：平板厚度为底层培养基为150ml，上层培养基为120ml，为确保平板厚度，利用250mL三角瓶进行定量盛装，一次使用，灭菌和使用方便。烟草赤星病菌经过均质器破碎后，向冷却到45-50℃的上层培养就加入8-12mL，摇匀，浇注成平板，28℃培养预培养1.5h，取出在凝固的平板上摆上牛津杯；4.标准曲线的建立：将多抗霉素的标品溶于缓冲液中，分别配置成25IU/mL、50IU/mL、100IU/mL；分别滴入牛津杯中，每个牛津杯加200μL，测抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径为横坐标，标品浓度的对数作纵坐标，绘制标准曲线；5.样品的含量测定：将筛选的发酵液用PH＝6.8的缓冲液稀释至600倍，滴入牛津杯中，盖好玻璃将平板放入28℃培养箱培养16-20好，取出，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，代入标准曲线中计算发酵液的含量。本专利技术通过确定利用自制装置对多抗霉素生物检测的最佳条件，其优点在于每个玻璃木盘中都滴入标准液，可独立绘制标准曲线，减少误差，另外才方法玻璃木盘的浇注的平板面积大，浇注方便，测量样品的数量多，有利于菌种的高通量筛选。附图说明：图1：生物效价检测法的效果图图2：杯碟法检测标品绘制的标准曲线图3：HPLC线性方程。具体实施方法实施例一步骤1.杯碟法多抗霉素的生物效价测定条件的确定测定条件：取多抗霉素标准品溶于pH＝6.8的磷酸盐缓冲液，再依次稀释到25IU/mL、50IU/mL、100IU/mL，样品根据酸化量、过滤速度、滤液色泽等因素进行估值，稀释不同倍数，按照估值最终稀释到50IU/mL，将标样、稀释液滴入同一玻璃木盘中的牛津杯中，盖好玻璃培养16-20小时，测定抑菌圈的直径，绘制标准曲线，计算样品含量①平板浇制：上层培养基为PDA培养基，(马铃薯200克去芽去皮切块，加蒸馏水1000ml煮汁，六层纱布过滤，加入至刻度，加1％葡萄糖、2％琼脂粉，调节PH＝6.2)，分装120ml/250ml三角瓶，灭菌备用；下层培养基2％琼脂粉，分装150ml/500ml三角瓶，灭菌备用；将玻璃木盘用75％的酒精棉由内向外依次擦拭，放入45℃的恒温无菌室中保温1小时，将底层培养基冷却到50-60℃，迅速倒入玻璃木盘中左右轻轻摇匀，凝固，将上层培养基冷却到45-50℃，加入由均质器打碎的烟草赤星菌病8-12ml，同时加入1ml单位为30IU链霉素，轻微震荡，避免产生气泡，倒入已凝固的底层培养基上，待上层培养基凝固后放入28℃培养箱预培养1-1.5小时，取出将牛津杯按照8*5的排列，顺序摆放，将稀释好的样品及标品，滴入牛津杯中，滴加量200μL，盖好玻璃盖，28℃培养16-20h，取走牛津杯，依次测定抑菌圈的直径，绘制标准曲线，计算样品含量；②.琼脂用量及胨化程度的确定：不同品牌的琼脂用量和胨化程度有所不同，胨化强度不佳，直接影响液体的扩散，使抑菌圈不圆，边缘不规整等，通过试验对红旗牌、乘风牌、海燕牌琼脂进行甄别筛选，最终确定，海燕牌琼脂2％，胨化较好、扩散效果好，抑菌圈效果最佳；③.指示菌使用方法的确定：经过PDA液体培养基培养的指示菌是球状，结团不分散，无法使用。要利用均质器将其打破，破碎程度上表现在肉眼可分辨不大于0.5mm的即可，加入指示菌时要严格控制上层培养基的温度，温度过高会杀死指示菌，温度过低凝固，无法形成均相的菌悬液；加入量过多，菌悬液浓度过高，菌活量大，抑菌作用不明显，加入量过少，菌悬液浓度过低则菌体生长稀疏，抑菌圈不明显或者不规则，难以准确测量。步骤2，标准曲线的建立及含量的计算①标准曲线的建立：在每个测定的玻璃木盘上中标准位置上都滴加在标准的位置上滴加25IU/mL、50IU/mL、100IU/mL的标准稀释液，每一个滴定盘对应一条标准曲线，这就保证了在相同的培养条件下的同步性，在一般情况下，标准单位对应的抑菌圈直径如下：25IU/mL24.1mm50IU/mL27.9mm100IU/mL31.2mm绘制标准曲线为Y＝0.0832X-0.6115,R2＝0.9990②样品的计算：将样品的抑菌圈直径的平均值代入标准曲线的X中，计算Y值，将y值作10的指数计算数值乘以稀释倍数即得样品的含量；杯碟法利用烟草赤星作为指示菌测多抗霉素含量步骤如下：1.试验器材的准备自制玻璃木盘用酒精棉由内向外依次擦拭干净，同时放入恒温无菌室中紫外灭菌45分钟，牛津杯选择为同一厂家同一批次，保证管理厚薄，重量均匀，牛津杯清洗干净后，浸泡在75％的酒精中，使用前取出对牛皮纸包裹，在烘干箱中烘干使用；2.样品与标准品溶液的配置标准品一次性称取一定量配置标准母液，4℃冰箱内保存，每次使用取出母液，稀释到25IU/mL、50IU/mL、100IU/mL浓度，样品按照估值，稀释一定倍数本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.确定一种利用烟草赤星病菌快速定量分析多抗霉素B的生物效价的方法其特征在于，在如下步骤（1）确定此方法专用的自制木盘，盘为30*20*4底面镶嵌玻璃作底用34*24的玻璃做盖子；（2）确定杯碟法测定多抗霉素B的生物检测条件，下层培养基加量为150mL，上层培养基加量为125mL指示菌加量为8‑12mL，牛津杯滴加样品量为200µL；（3）标准曲线的建立：取多抗霉素B样品，用缓冲液稀释到，25IU/mL、50 IU/mL 、100 IU/mL，测不同浓度抑菌圈直径大小，并用抑菌圈直径为横坐标，多抗霉素B浓度的对数值为纵坐标，绘制标准曲线；（4）赤星病菌指示菌的制备；（5）HPLC检测方法采用C18 柱进行检测，用甲醇：水=10：90作为流动相，完成检测实验。

【技术特征摘要】
1.确定一种利用烟草赤星病菌快速定量分析多抗霉素B的生物效价的方法其特征在于，在如下步骤（1）确定此方法专用的自制木盘，盘为30*20*4底面镶嵌玻璃作底用34*24的玻璃做盖子；（2）确定杯碟法测定多抗霉素B的生物检测条件，下层培养基加量为150mL，上层培养基加量为125mL指示菌加量为8-12mL，牛津杯滴加样品量为200µL；（3）标准曲线的建立：取多抗霉素B样品，用缓冲液稀释到，25IU/mL、50IU/mL、100IU/mL，测不同浓度抑菌圈直径大小，并用抑菌圈直径为横坐标，多抗霉素B浓度的对数值为纵坐标，绘制标准曲线；（4）赤星病菌指示菌的制备；（5）HPLC检测方法采用C18柱进行检测，用甲醇：水=10：90作为流动相，完成检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓庆，杨孟森，宫照普，
申请(专利权)人：乳山韩威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37