高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术提供的重组菌，包括如下步骤：1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性，得到目的菌A；2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；3)抑制所述目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。本发明专利技术的实验证明，在大肠杆菌体内构建丁醇合成途径后，敲除相关副产物基因并加强丁醇途径基因的表达可以大幅度提高丁醇的产量。

Escherichia coli genetic engineering strain with high butanol production and its construction method and Application

The invention discloses Escherichia coli genetic engineering bacteria with high butanol production and its construction method and application. The recombinant bacteria provided by the invention comprises the following steps: 1) inhibition of butanol production of bacterial DNA pykA gene expression and / or activity, and increase the expression of bacterial DNA FDH gene and / or activity to bacteria A; 2) medium acclimated bacteria A in nitrogen source is not objective rich M9, get the target bacteria B; 3) inhibit the expression of the target bacteria B genome yieP, stpA, yqeG and yagM genes and / or activity, and increase the expression of the objective bacteria B ter gene and CRT gene and / or activity by recombinant bacteria. The experiment in this study proved that the production of butanol could be greatly improved by knocking out the related by-products and enhancing the expression of butanol pathway genes after the construction of butanol biosynthesis pathway in Escherichia coli.

【技术实现步骤摘要】
高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
能源与环境是当今社会关注的焦点。随着化石能源的日渐枯竭和自然环境的污染，人类对可再生能源的需求越来越强烈。利用微生物转化或发酵可再生资源高效生产可再生能源是今后的能源发展趋势，这种通过生物法生产化学品的方式是可持续的且环境友好的。丁醇是一种重要的化工品和原料，可直接用作有机溶剂，是合成多种酯类化合物的前体，广泛应用于各种塑料和橡胶制品中。同时，丁醇也是优良的可替代汽油的生物燃料。它具有和汽油相当的热值与辛烷值，可与汽油以任意比例混合；在运输过程中，不易腐蚀管道；与乙醇相比，其蒸汽压低，安全性高，因此是一种极具潜力的新型生物燃料。目前，丁醇的年市场需求大约在百万吨级别。丁醇可由生物合成是巴斯德于1861年首次发现的，1912年，魏兹曼(Weizmann)发现了一种梭菌Clostridiumacetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酮丁醇梭菌，以期得到可用于工业化生产丁醇的工程菌株。但是，丙酮丁醇梭菌是一种严格厌氧生长的革兰氏阳性细菌，其遗传操作系统复杂，不利于进行实验室的研究和工业的生产。2008年，ShotaAtsumi,JamesC.Liao等首先在大肠杆菌中实现了丁醇的合成(AtsumiS,CannAF,ConnorMR,etal.MetabolicengineeringofEscherichiacolifor1-butanolproduction.Metabolicengineering,2008,10(6):305-311.)，该研究组将丙酮丁醇梭菌体内的丁醇合成途径转移至大肠杆菌内，致使其可产生少量丁醇。随后，该研究组对整条途径进行了优化，将以NADH为还原力，催化可逆反应巴豆酰辅酶A生成丁酰辅酶A的丁酰辅酶A脱氢酶复合物(Bcd-EtfABcomplex)替换为来自齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)的催化不可逆反应的反式烯酰辅酶A还原酶(Ter)；催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A的酶，由乙酰乙酰辅酶A硫解酶(Thl)换为大肠杆菌中活性更强的乙酰辅酶A乙酰转移酶(AtoB)，由此形成了NADH和乙酰辅酶A的驱动力，丁醇产量大幅度提高。目前的丁醇生产菌株都是基于质粒表达基因，并且使用诱导型启动子，所以不适用于大规模的工业化生产。适合大规模生产丁醇的工业菌株需要所有的基因操作在染色体水平进行以保持遗传稳定性，不需要诱导剂，并且要有较高的产量和得率以降低分离成本和原料成本，这样的菌株目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。本专利技术提供的重组菌，包括如下步骤：1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性，得到目的菌A；2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；3)抑制所述目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。上述方法中，所述抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上pykA基因；所述提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性为增加所述出发菌基因组中fdh基因的拷贝数；所述抑制目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上的yieP、stpA、yqeG和yagM基因全部或部分片段；所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性为增加目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数。上述方法中，所述增加出发菌基因组中fdh基因的拷贝数为将fdh基因及其启动子整合到所述出发菌基因组上；所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数为将ter基因及其RBS和crt基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组上。上述方法中，所述敲除或整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。上述方法中，所述敲除出发菌基因组上pykA基因为采用λ-red同源重组系统将所述出发菌基因组上的pykA基因替换为FRT；所述FRT为序列14第59-106位；所述将fdh基因及其启动子整合到目的菌A基因组为采用整合质粒将所述出发菌基因组上maeB基因替换为含有fdh及其启动子的片段1，且将所述出发菌基因组上位于mdh基因位点的FRT替换为含有fdh及其启动子的片段2；位于mdh基因位点的FRT为在制备出发菌时，将初始菌中的mdh基因替换为FRT。所述含有fdh及其启动子的片段1的核苷酸序列具体为序列23第941-2535位核苷酸；所述含有fdh及其启动子的片段2的核苷酸序列具体为序列24第931-2525位核苷酸；所述敲除出发菌基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因部分片段为采用CRISPR/Cas系统分别敲除yieP基因序列第70-619位核苷酸、stpA基因序列第74-373位核苷酸、yqeG基因序列第1-695位核苷酸、yagM基因序列第121-855位核苷酸；所述采用CRISPR/Cas系统敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的靶基因分别为yieP、stpA、yqeG、yagM基因；所述采用CRISPR/Cas系统敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的sgRNA的核苷酸序列分别为序列33、序列34、序列35、序列27；所述将ter基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组为采用CRISPR/Cas系统将含有ter基因及其RBS的片段替换所述目的菌B基因组上yciA基因；所述含有ter基因及其RBS的片段的核苷酸序列为序列25；所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的靶基因为yciA基因；所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的sgRNA的核苷酸序列为序列28；所述将crt基因及其RBS整合到目的菌B基因组为将所述含有crt基因及其RBS的片段采用CRISPR/Cas系统替换目的菌B基因组上poxB基因；所述含有crt基因及其RBS的片段的核苷酸序列为序列26；所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的靶基因为poxB基因；所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的sgRNA的核苷酸序列为序列29。上述方法中，步骤2)中，所述在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A包括如下步骤：2)-1，将所述目的菌A在葡萄糖为碳源的M9培养基中转接驯化，得到丁醇产量大于6g/L的菌株；其中，转接驯化的次数为52次，每次转接驯化的培养时间为1天；2)-2，将2)-1得到的所述丁醇产量大于6g/L的菌株在葡萄糖酸作为碳源的改良M9培养基转接驯化直到得到丁醇产量不变菌株；其中，转接驯化的次数为49次，每次转接驯化培养1天；2)-3，将2)-2得到的丁醇产量不变菌株在所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性，得到目的菌A；2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；3)抑制所述目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性，得到目的菌A；2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；3)抑制所述目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上pykA基因；所述提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性为增加所述出发菌基因组中fdh基因的拷贝数；所述抑制目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上的yieP、stpA、yqeG和yagM基因全部或部分片段；所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性为增加目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述增加出发菌基因组中fdh基因的拷贝数为将fdh基因及其启动子整合到所述出发菌基因组上；所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数为将ter基因及其RBS和crt基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组上。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述敲除或整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述敲除出发菌基因组上pykA基因为采用λ-red同源重组系统将所述出发菌基因组上的pykA基因替换为FRT；所述FRT具体为序列14第59-106位；所述将fdh基因及其启动子整合到目的菌A基因组为采用整合质粒将所述出发菌基因组上maeB基因替换为含有fdh及其启动子的片段1，且将所述出发菌基因组上位于mdh基因位点的FRT替换为含有fdh及其启动子的片段2；所述含有fdh及其启动子的片段1的核苷酸序列具体为序列23第941-2535位核苷酸；所述含有fdh及其启动子的片段2的核苷酸序列具体为序列24第931-2525位核苷酸；所述敲除出发菌基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因部分片段为采用CRISPR/Cas系统分别敲除yieP基因序列第70-619位核苷酸、stpA基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：董红军，赵春华，张天瑞，朱华伟，林兆，张延平，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11