一种药物纳米制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种药物纳米制剂及其制备方法。该药物纳米制剂包括纳米载体，所述纳米载体为由亲水外链和疏水内核组成的核壳结构所述亲水外链为水溶性聚合物或水溶性多糖；所述疏水内核为聚酰胺‑胺，其表面吸附有siRNA，内部包埋有抗肿瘤药物和疏水性探针；所述亲水外链与疏水内核通过偶氮苯‑4，4‑二羧酸连接。本发明专利技术首次采用偶氮苯‑4，4‑二羧酸(AZO)连接甲氧基聚乙二醇胺(PEG)与聚酰胺‑胺(PAMAM)制备了一种低氧响应性的纳米载体，可用于共载化疗药物和siRNA；该纳米制剂不仅在肿瘤低氧微环境刺激下粒径减小，穿透性强；而且制剂工艺简单，对肿瘤细胞的毒性增加。

Pharmaceutical nano preparation and its preparation method

The invention discloses a medicine nanometer preparation and its preparation method. The nano drug formulations including nanoparticles, the nanoparticles with core-shell structure by hydrophilic chain and a hydrophobic core composed of the hydrophilic chain is a water-soluble polymer or water soluble polysaccharide; the hydrophobic core of polyamide amine, the adsorption of siRNA, internal encapsulating anticancer drugs and hydrophobic probe; the hydrophilic and hydrophobic chain azobenzene kernel by 4, 4 connected two carboxylic acid. The invention is used for the first time in 4 azobenzene 4, two carboxylic acid (AZO) with methoxy polyethylene glycol amine (PEG) and polyamide amine (PAMAM) preparation of a nano carrier of hypoxia response, can be used for carrying drugs and siRNA; the nanoparticles not only in tumor microenvironment hypoxia stimulation the decrease of particle size, strong penetrability; and the preparation process is simple, the increase of tumor cell toxicity.

【技术实现步骤摘要】
一种药物纳米制剂及其制备方法
本专利技术涉及纳米载药制剂的制备领域，尤其涉及一种药物纳米制剂及其制备方法。
技术介绍
癌症是引起人类死亡的第二大原因，肿瘤发病率和死亡率居高不下，使其成为医疗领域的重大挑战之一。化疗仍然是目前最主要的肿瘤治疗手段，但传统的标准化疗往往会产生多种不可避免的副反应及系统毒性。纳米传递系统的出现提高了药物对肿瘤部位的靶向性，使得药物更多得聚集于肿瘤部位，从而大大降低了对其他正常组织器官的毒副作用。目前已有多个抗肿瘤纳米制剂问世，比如Doxil和Abraxane。现有技术中，关于抗肿瘤纳米制剂的研究较多。利用肿瘤微环境内低氧、偏酸、高压等特点设计纳米给药系统是当前的热点。如Zhu等合成的MMP2敏感脂质体可携载多柔吡星(DOX)治疗乳腺癌。Cheng等将MMP2敏感穿透肽(R9GPLGLAGE8,ACPP)与原卟啉结合形成胶束用于光动力学治疗。在成像方面，YapingWang等制备的高效低毒纳米探针可用于探测MMP2高表达的细胞和肿瘤。然而，在肿瘤部位，细胞外基质更加致密、血管异常化、组织间隙液压增高，受这些因素影响，纳米粒子通常只能被动地聚集在疏漏的肿瘤血管周围，而不能渗透整个肿瘤组织。同时，绝大部分实体瘤都存在的低氧特性造成肿瘤细胞的转录因子HIF1alpha表达水平过高，这是导致肿瘤产生化学耐药的重要原因之一。目前的传统纳米制剂并不能很好地解决上述这两个问题。因此，构建一个具有肿瘤靶向性并可穿透进入肿瘤内部克服肿瘤低氧耐药问题的药物递送系统十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有纳米制剂难以渗透进入肿瘤内部及克服肿瘤耐药问题的不足，提供了一种药物纳米制剂及其应用，该药物纳米制剂是一种可共载化疗药物和siRNA的纳米载体，其在肿瘤低氧微环境刺激下粒径减小进而促进穿透，进入肿瘤内部，提高对肿瘤细胞的毒性。一种药物纳米制剂，包括纳米载体，所述纳米载体为由亲水外链和疏水内核组成的核壳结构，所述亲水外链为水溶性聚合物或水溶性多糖；所述疏水内核为聚酰胺-胺，内部包埋有抗肿瘤药物；所述亲水外链与疏水内核通过偶氮苯-4，4-二羧酸连接。上述聚酰胺-胺是一种表面带大量正电的树状大分子物质，能够与低氧刺激响应性小分子偶氮苯-4，4-二羧酸通过酰胺键连接；其表面正电荷能够吸附带负电的核酸。本专利技术制备的药物纳米制剂(简称：纳米制剂)中的纳米载体为亲水性外链包裹疏水性内核的壳核式结构，疏水性内核可大量包埋疏水性药物，而带正电性的疏水内核易吸附负电的核酸。纳米载体利用亲水性外壳在体内长循环并通过EPR效应聚集于肿瘤部位后，在肿瘤低氧还原的微环境下，偶氮苯-4，4-二羧酸的偶氮双键断裂，纳米粒子的亲水性外壳脱去，暴露出携载药物和核酸的表面阳离子的小粒径树状大分子，渗透进入肿瘤组织内部细胞，并在溶酶体内发生质子化效应，逃逸进入细胞浆，同时释放抗肿瘤药物和核酸。其中，功能性核酸可用于抑制耐药基因的表达，从而联合药物杀伤低氧条件下的耐药细胞，同时利用该纳米载体携载功能性探针可有效实时反馈药效。所述的亲水外链可以为水溶性聚合物，如甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)；或者水溶性多糖，如透明质酸(Hyaluronan,HA)，肝素，葡聚糖，海藻酸钠等。作为优选，所述亲水外链的分子量为800Da～1000000Da。若选用的亲水外链的分子量较大，最终形成的纳米制剂的粒径会增加，因此要选用适合的分子量，以控制纳米制剂的粒径。作为优选，所述亲水外链为聚乙二醇类衍生物。更优选，所述亲水外链为为甲氧基聚乙二醇胺。甲氧基聚乙二醇胺生物相容性好，能减小纳米制剂的毒性，同时可有效增加纳米制剂体内循环时间，提高纳米制剂的肿瘤靶向性。进一步地，纳米载体中，所述偶氮苯-4，4-二羧酸和甲氧基聚乙二醇胺的摩尔比为1:1；聚酰胺-胺与偶氮苯-4，4-二羧酸的摩尔比为1：(10～50)。作为优选，所述甲氧基聚乙二醇胺的分子量为800～8000Da，此时纳米粒的粒径在100～300nm，利于纳米粒蓄积在肿瘤部位。所述的抗肿瘤药物为疏水性药物，选自盐酸阿霉素、博来霉素、佐柔比星、表柔比星、柔红霉素、喜树碱和紫杉醇中的一种。聚酰胺-胺是高度枝化的单分散大分子，以乙二胺为核，与丙烯酸甲酯通过Michael加成和酰胺化反应得到，具有高度的几何对称性。低代数的树状大分子是开放的结构，但随着代数的增长，分子量与表面反应基团约增加为前一代的两倍。4代及4代以上聚酰胺-胺的整体结构逐渐呈现球形，内部存在空腔，可以包裹药物分子。作为优选，所述的疏水内壳为5代聚乙二胺树枝状聚合物(polyamidoaminedendrimer,PAMAM)，抗肿瘤药物为盐酸阿霉素；抗肿瘤药物通过旋蒸法包埋于PAMAM的内部空腔中；所述纳米载体与盐酸阿霉素的质量比为1:(0.01～0.5)。进一步地，所述疏水内壳表面吸附有siRNA，所述siRNA为低氧诱导因子-1αsiRNA。(HIF1alphasiRNA)。绝大部分实体瘤都存在的低氧特性造成肿瘤细胞的转录因子HIF1alpha表达水平过高，这是导致肿瘤产生化学耐药的重要原因之一。通过HIF1alphasiRNA可沉默HIF1alpha的表达，克服低氧耐药的问题。作为优选，所述纳米载体与低氧诱导因子-1αsiRNA的摩尔比为(1～500):1。通过凝胶电泳实验与纳米制剂表面电位测量实验发现，该摩尔比下siRNA可完全吸附于纳米制剂表面，且易于与药物共载。进一步地，所述疏水内壳内部包埋有疏水性探针，所述疏水性探针为2',7'-二氯荧光黄双乙酸(DCFH-DA)；DCFH-DA已被证明是一种成熟的活性氧探针，易于标记于细胞内。作为优选，所述纳米载体与2',7'-二氯荧光黄双乙酸的摩尔比为(1～2000):1；该比例下，纳米载体易于携载2',7'-二氯荧光黄双乙酸。本专利技术还提供了所述纳米载体的制备方法，包括以下步骤：1)偶氮苯-4，4-二羧酸(AZO)用吡啶溶解后，加入羧基活化剂，活化AZO的羧基，得到活化的AZO溶液；2)甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)溶于吡啶后，加入活化的AZO溶液中，滴加三乙胺，室温搅拌过夜；得到PEG-AZO溶液；3)真空旋转蒸发除去PEG-AZO溶液中的吡啶溶液，纯水复溶，得PEG-AZO水溶液；纯化后，加入羧基活化剂，活化AZO的羧基，得到活化的PEG-AZO水溶液。4)将活化的PEG-AZO水溶液缓慢加入PAMAM水溶液中，用1mol/LNaOH调溶液pH至8，室温搅拌过夜；透析纯化后，冷冻干燥得PEG-AZO-PAMAM(PAP)纳米载体。上述纳米载体的合成路径如图1所示。本专利技术还提供了所述药物纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：1)将DOX·HCl溶解于甲醇：丙酮(1:1，v/v)混合溶剂中，加入三乙胺，碱化；再向碱化后的DOX溶液中加入PEG-AZO-PAMAM甲醇：丙酮(1:1，v/v)混合溶液，避光搅拌72h；2)50℃旋转蒸发，蒸干溶剂后，以PBS7.4水溶液复溶，置于透析袋(MWCO3500)中，PBS7.4水溶液介质中避光透析4h，得PAP+DOX制剂，避光4℃保存；3)将PAP+DOX制剂与siRNA混合于PBS7.4溶液中,37℃，100rpm恒温震荡30min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药物纳米制剂，包括纳米载体，所述纳米载体为由亲水外链和疏水内核组成的核壳结构，其特征在于，所述亲水外链为水溶性聚合物或水溶性多糖；所述疏水内核为聚酰胺‑胺，内部包埋有抗肿瘤药物；所述亲水外链与疏水内核通过偶氮苯‑4，4‑二羧酸连接。

【技术特征摘要】
1.一种药物纳米制剂，包括纳米载体，所述纳米载体为由亲水外链和疏水内核组成的核壳结构，其特征在于，所述亲水外链为水溶性聚合物或水溶性多糖；所述疏水内核为聚酰胺-胺，内部包埋有抗肿瘤药物；所述亲水外链与疏水内核通过偶氮苯-4，4-二羧酸连接。2.如权利要求1所述的药物纳米制剂，其特征在于，所述亲水外链为甲氧基聚乙二醇胺。3.如权利要求2所述的药物纳米制剂，其特征在于，纳米载体中，所述偶氮苯-4，4-二羧酸和甲氧基聚乙二醇胺的摩尔比为1:1；聚酰胺-胺与偶氮苯-4，4-二羧酸的摩尔比为1：(10～50)。4.如权利要求2所述的药物纳米制剂，其特征在于，所述甲氧基聚乙二醇胺的分子量为800～8000Da。5.如权利要求2所述的药物纳米制剂，其特征在于，所述疏水内壳为5代聚乙二胺树枝状聚合物；所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素。6.如权利要求2所述的药物纳米制剂，其特征在于，所述疏水内壳表面吸附有siRNA，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩旻，谢智奇，皇甫铭一，郭望葳，郭宁宁，林梦婷，王田田，刘惠娜，陈捷键，高建青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33