一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比与消光系数之比的方法技术

本发明专利技术公开一种基于激发发射光谱分离同时测量受体‑供体量子产额之比与消光系数之比的方法，属于FRET检测技术领域。该方法包括如下步骤：测量2种或2种以上受体个数与供体个数比值相同且FRET效率不同的供体‑受体串联样本的激发发射光谱SDA[i]，并将SDA[i]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离得到三个权重因子WD[i]，WA[i]和WS[i]；以WA/WD为自变量，WS/WD为因变量，线性拟合WA[i]/WD[i]、WS[i]/WD[i]，线性方程的斜率与nA/nD的乘积的倒数为KA/KD，截距的绝对值为QA/QD。本发明专利技术测量过程简单、测量时间短、测量结果稳定并且适用于不同的检测系统。

【技术实现步骤摘要】
一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比与消光系数之比的方法
本专利技术属于荧光共振能量转移(FRET)检测
，具体涉及一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比(QA/QD)与受体-供体消光系数之比(KA/KD)的方法。
技术介绍
基于荧光蛋白(FPs)的FRET显微术已经成为在活细胞中研究分子调控机制的重要工具。获得不依赖于检测系统和FPs表达水平的定量FRET信号是不同实验室之间进行学术交流和比较的前提。近年来，我们在宽场光谱显微成像系统上实现了一种基于激发发射光谱分离的定量FRET测量技术(ExEm-spFRET)，能够同时克服受体激发串扰和供体发射串扰[MengyanDu,etal.“Wide-fieldmicroscopicFRETimagingusingsimultaneousspectralunmixingofexcitationandemissionspectra”,Opt.Express24(14),16037-16051(2016)]。受体-供体量子产额之比(QA/QD)与受体-供体消光系数之比(KA/KD)是许多定量FRET检测技术必不可少的两个重要参量。KA/KD与激发光源的光谱性质、测量系统激发通道的传输函数以及供体和受体的吸收光谱有关。Wlodarczyk[WlodarczykJ,WoehlerA,KobeF,etal.“AnalysisofFRETsignalsinthepresenceoffreedonorsandacceptors”,BiophysicalJournal94(3),986-1000(2008)]等人通过测量串联质粒样本在双波长激发时的激发比来得到KA/KD，该方法要求所有FRET测量过程中系统设置保持不变。Zhang[ZhangJ,YangF,ChaiL,etal.“Spectralmeasurementofacceptor-to-donorextinctioncoefficientratioinlivingcells”,Micron68(1),98-106(2015)]等人提出的sp-ECR方法测量KA/KD时需要借助一个FRET效率已知的串联质粒样本。对于QA/QD的值，大多数FRET相关研究都是通过引用文献中报道的荧光基团的量子产额值得到。但是实际上QA/QD不仅与供体、受体荧光基团的光学性质有关，还与荧光基团所处的环境以及测量系统发射通道的光谱响应性能有关。所以，在给定的测量系统上同时且准确测得QA/QD和KA/KD的值是多种定量FRET检测的前提条件。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比(QA/QD)与受体-供体消光系数之比(KA/KD)的方法。该方法利用2种或2种以上受体个数与供体个数比值相同且FRET效率不同的供体-受体串联样本同时测量QA/QD和KA/KD。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：分别获得单转供体样本、单转受体样本以及2种或2种以上受体个数与供体个数比值相同且FRET效率不同的供体-受体串联样本。通过线性分离供体-受体串联样本的激发发射光谱可以快速测定在给定的测量系统条件下QA/QD和KA/KD值，并且无需测量供体-受体串联样本的FRET效率。一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比(QA/QD)与受体-供体消光系数之比(KA/KD)的方法，包括以下步骤：(1)测量2种或2种以上受体个数与供体个数比值(nA/nD)相同且FRET效率不同的供体-受体串联样本的激发发射光谱(SDA[i])，并将SDA[i]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离得到三个权重因子WD[i]，WA[i]和WS[i]；其中下标i表示第i种供体-受体串联样本，i≥2；(2)根据步骤(1)得到的WD[i]、WA[i]和WS[i]计算WA[i]/WD[i]和WS[i]/WD[i]的值；(3)以WA/WD为自变量，WS/WD为因变量，线性拟合步骤(2)中得到的WA[i]/WD[i]、WS[i]/WD[i]，线性方程的斜率与nA/nD的乘积的倒数即为KA/KD，线性方程的截距的绝对值即为QA/QD。步骤(1)中所述的三个激发发射光谱基矢分别为供体的激发发射光谱基矢SD、受体的激发发射光谱基矢SA、供受体敏化的激发发射光谱基矢SS；步骤(1)中所述的WD[i]为供体激发发射光谱所占权重，WA[i]为受体激发发射光谱所占权重，WS[i]为供受体敏化激发发射光谱所占权重；步骤(1)中所述的供体-受体串联样本适用于所有串联质粒的供体-受体串联样本，其中受体个数与供体个数比值(nA/nD)优选为0.5～3；最优选为1：1。具体包括以下步骤：(1)获得单转供体样本和单转受体样本，测量供体的激发发射光谱基矢SD，受体的激发发射光谱基矢SA，以及供受体敏化的激发发射光谱基矢SS；(2)获得2种或2种以上受体个数与供体个数比值(nA/nD)相同且FRET效率不同的供体-受体串联样本，测量供体-受体串联样本的激发发射光谱(SDA[i])，并将SDA[i]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子WD[i]，WA[i]和WS[i]；SDA[i]＝WD[i]SD+WS[i]SS+WA[i]SA(2)(3)根据步骤(2)得到的WD[i]、WA[i]和WS[i]计算WA[i]/WD[i]和WS[i]/WD[i]的值。(4)以WA/WD为自变量，WS/WD为因变量线性拟合步骤(3)得到的WA[i]/WD[i]、WS[i]/WD[i]，线性方程的斜率与nA/nD的乘积的倒数即为KA/KD，线性方程的截距的绝对值即为QA/QD。其中，WA/WD、WS/WD、KA/KD和QA/QD四者满足如下关系：为了更好的阐述本专利技术，下面以一个测量QA/QD和KA/KD的实例进行说明：给定的供体-受体串联样本(nA/nD＝1)：供体为Cerulean(简称C)，受体为Venus(简称V)。供体-受体串联样本C32V：由32个氨基酸的连接序列将C和V链接组成的供体-受体串联样本。供体-受体串联样本C17V：由17个氨基酸的连接序列将C和V链接组成的供体-受体串联样本。供体-受体串联样本CTV：由229个氨基酸的连接序列将C和V链接组成的供体-受体串联样本。具体测量过程如下：(1)在人的肝癌细胞(HepG2细胞)中单独转染并表达供体C和受体V，以及供体-受体串联样本C32V、C17V和CTV；(2)用宽场荧光显微镜和相机测量C和V的激发谱和发射谱。选择436±10nm和470±10nm两个激发波段作为激发光；选择470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm六个发射波段作为探测通道。经过测量和计算可以得到归一化的C的激发谱和发射谱以及归一化的V的激发谱和发射谱(3)根据和的外积得到供体的激发发射光谱基矢(SD)，和的外积得到受体的激发发射光谱基矢(SA)，以及和的外积得到供受体敏化的激发发射光谱基矢(SS)：(4)测量供体-受体串联样本C32V、C17V和CTV的激发发射光谱(SDA[i])。用436±10nm的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于激发发射光谱分离同时测量受体‑供体量子产额之比与受体‑供体消光系数之比的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)测量2种或2种以上受体个数与供体个数比值相同且FRET效率不同的供体‑受体串联样本的激发发射光谱SDA[i]，并将SDA[i]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离得到三个权重因子WD[i]，WA[i]和WS[i]；其中下标i表示第i种供体‑受体串联样本，i≥2；所述的三个激发发射光谱基矢分别为供体的激发发射光谱基矢SD、受体的激发发射光谱基矢SA、供受体敏化的激发发射光谱基矢SS；所述的WD[i]为供体激发发射光谱所占权重，WA[i]为受体激发发射光谱所占权重，WS[i]为供受体敏化激发发射光谱所占权重；(2)根据步骤(1)得到的WD[i]、WA[i]和WS[i]计算WA[i]/WD[i]和WS[i]/WD[i]的值；(3)以WA/WD为自变量，WS/WD为因变量，线性拟合步骤(2)中得到的WA[i]/WD[i]、WS[i]/WD[i]；线性方程的斜率与nA/nD的乘积的倒数即为KA/KD，线性方程的截距的绝对值即为QA/QD。

【技术特征摘要】
1.一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比与受体-供体消光系数之比的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)测量2种或2种以上受体个数与供体个数比值相同且FRET效率不同的供体-受体串联样本的激发发射光谱SDA[i]，并将SDA[i]按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离得到三个权重因子WD[i]，WA[i]和WS[i]；其中下标i表示第i种供体-受体串联样本，i≥2；所述的三个激发发射光谱基矢分别为供体的激发发射光谱基矢SD、受体的激发发射光谱基矢SA、供受体敏化的激发发射光谱基矢SS；所述的WD[i]为供体激发发射光谱所占权重，WA[i]为受体激发发射光谱所占权重，WS[i]为供受体敏化激发发射光谱所占权重；(2)根据步骤(1)得到的WD[i]、WA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈同生，张晨爽，林方睿，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44