葡萄黑腐病菌实时荧光PCR检测方法及其专用引物探针组技术

本发明专利技术公开了一种葡萄黑腐病菌实时荧光PCR检测方法及其专用引物探针组。本发明专利技术首先提供了一种特异引物对，由序列表的序列1所示的引物PAF和序列表的序列2所示的引物PAR组成。本发明专利技术还保护一种引物探针组，包括所述特异引物对和探针；所述探针的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。本发明专利技术还保护所述特异引物对或所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)鉴定葡萄黑腐病菌；(b2)制备用于鉴定葡萄黑腐病菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌；(b4)制备用于检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的试剂盒。本发明专利技术对于葡萄黑腐病菌的检测以及防控具有重大的应用推广价值。

Detection of black rot fungus of Grape by real-time fluorescent PCR and its specific primer probe group

The present invention discloses a real-time fluorescence PCR detection method for grape black rot fungus and its special primer probe group. The invention first provides a pair of specific primers, consisting of the primer PAF and the sequence of the sequence table 1, and the primer PAR. The invention also protects a primer probe group, comprising the specific primer pair and probe; one end of the probe has a fluorescent reporter group, and the other end has a fluorescence quenching group. The invention also protects the specific primer of the primer probe or application group, as follows (B1), (B2), (B3) or (B4): (B1) identification of grape black rot; (B2) preparing a kit for the identification of Grape Black Rot (B3) detection; the tested samples contain grape black rot; (B4) preparation for detecting whether the sample kit containing Grape Black rot. The invention has great application and promotion value for the detection and prevention and control of Grape Black Rot pathogen.

【技术实现步骤摘要】
葡萄黑腐病菌实时荧光PCR检测方法及其专用引物探针组
本专利技术涉及检疫性真菌的检测技术，具体涉及一种葡萄黑腐病菌实时荧光PCR检测方法及其专用引物探针组。
技术介绍
葡萄黑腐病菌Phyllostictaampelicida(Engelm.)隶属于叶点霉属(Phyllosticta)、球壳孢科(Phyllostictaceae)、葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、子囊菌门(Ascomycota)。葡萄黑腐病菌已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，是一种检疫性植物病原真菌。目前，分布于美国、澳大利亚、新西兰、巴西、南非、希腊、印度、日本和我国局部地区。葡萄黑腐病菌可侵染葡萄的果实和枝叶，对鲜食葡萄和酒用葡萄的都有严重影响,使葡萄的产量和果实的质量、风味下降。迄今为止，国内外检测葡萄黑腐病菌的方法局限于形态学检测方法，费时费力，且对检测人员专业素质要求较高，难以满足快速、准确、灵敏鉴定的检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种葡萄黑腐病菌实时荧光PCR检测方法及其专用引物探针组。本专利技术首先提供了一种特异引物对，由引物PAF和引物PAR组成；所述引物PAF为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物PAR为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。所述特异引物对的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)鉴定葡萄黑腐病菌；(b2)制备用于鉴定葡萄黑腐病菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌；(b4)制备用于检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的试剂盒。本专利技术还保护一种引物探针组，包括所述特异引物对和探针；所述探针的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。所述探针，5'末端具有荧光报告基团FAM，3'末端具有荧光淬灭基团MGB。所述探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，进行PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。所述引物探针组的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)鉴定葡萄黑腐病菌；(b2)制备用于鉴定葡萄黑腐病菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌；(b4)制备用于检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的试剂盒。本专利技术还保护所述特异引物对或所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)鉴定葡萄黑腐病菌；(b2)制备用于鉴定葡萄黑腐病菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌；(b4)制备用于检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的试剂盒。本专利技术还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对或所述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定葡萄黑腐病菌；(c2)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌。本专利技术还保护一种鉴定葡萄黑腐病菌的方法，包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA为模板，采用所述引物探针组进行实时荧光PCR并检测荧光信号，如果显示阳性扩增曲线、待测菌为或候选为葡萄黑腐病菌，如果不显示阳性扩增曲线、待测菌为或候选为非葡萄黑腐病菌。所述待测菌可为待测真菌。所述待测菌可为葡萄黑腐病菌、Phyllostictaparthenocissi、Phyllostictavaccinii、Phyllostictacarochlae、Phyllostictaconcentrica、Phyllostictayuccae、Guignardiagaultheriae、Phyllostictacapitalensis、Phyllostictaschimae、Phyllostictahostae、Phyllostictailicis–aquifolii、Phyllostictastyracicola、Phyllostictapartricuspidatae、Phyllostictaschimicola、Phyllostictavitis-rotundifoliae、尖孢镰孢菌、茄病镰孢菌、三线镰孢菌、砖红镰孢菌、木贼镰孢菌、大丽轮枝菌或黑白轮枝菌。本专利技术还保护一种检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的方法，包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用所述引物探针组进行实时荧光PCR并检测荧光信号，如果显示阳性扩增曲线、待测样本含有或疑似含有葡萄黑腐病菌，如果不显示阳性扩增曲线、待测样本不含有或疑似不含有葡萄黑腐病菌。以上任一所述实时荧光PCR的反应体系中，引物PAF浓度为0.5μmol/L，引物PAR浓度为0.5μmol/L，探针PAP浓度为0.5μmol/L。以上任一所述实时荧光PCR的反应体系可由UniversalPCRMasterMix、引物PAF、引物PAR、探针PAP、模板和水组成。以上任一所述实时荧光PCR的反应条件为：50℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。本专利技术还保护一种鉴定葡萄黑腐病菌的方法，包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR，如果显示特异扩增产物、待测菌为或候选为葡萄黑腐病菌，如果不显示特异扩增产物、待测菌为或候选为非葡萄黑腐病菌。本专利技术还保护一种检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的方法，包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR，如果显示特异扩增产物、待测样本含有或疑似含有葡萄黑腐病菌，如果不显示特异扩增产物、待测样本不含有或疑似不含有葡萄黑腐病菌。以上任一所述特异扩增产物可为107bp-117bp的扩增产物。以上任一所述特异扩增产物具体可为112bp的扩增产物。以上任一所述待测样本可为植物样品、真菌纯培养样品等。所述植物样本具体可为植物叶片或植物果实，更具体可为葡萄叶片或葡萄果实。本专利技术还保护一种检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否具有所述特异引物对的靶序列，如果具有所述靶序列、待测样本含有或疑似含有葡萄黑腐病菌，如果不具有所述靶序列、待测样本不含有或疑似不含有葡萄黑腐病菌。所述靶序列为如下(d1)或(d2)：(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。本专利技术针对现有葡萄黑腐病菌检测方法费时、繁琐、专业人员素养要求高的缺点，提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测葡萄黑腐病菌的方法。本专利技术进一步优化了实时荧光PCR的反应体系，获得了最优的引物浓度和探针浓度。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)快速简单：只需少量样品DNA，用荧光PCR仪仅需1小时就可完成PCR步骤，得到检测结果，且避免了普通分子检测技术中的电泳等处理过程；(2)特异性强：采用针对葡萄黑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异引物对，由引物PAF和引物PAR组成；所述引物PAF为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物PAR为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种特异引物对，由引物PAF和引物PAR组成；所述引物PAF为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物PAR为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。2.一种引物探针组，包括权利要求1所述特异引物对和探针；所述探针的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于：所述探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。4.权利要求1所述特异引物对或权利要求2或3所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)鉴定葡萄黑腐病菌；(b2)制备用于鉴定葡萄黑腐病菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌；(b4)制备用于检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的试剂盒。5.一种试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对或权利要求2或3所述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定葡萄黑腐病菌；(c2)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌。6.一种鉴定葡萄黑腐病菌的方法，包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA为模板，采用权...

【专利技术属性】
技术研发人员：段维军，郭立新，段丽君，李雪莲，张慧丽，陈先锋，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33