一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白由猪白细胞介素2与猪干扰素γ经柔性linker连接而形成，融合蛋白与冻干保护剂混配后经冷冻干燥即可得到重组猪长效干扰素γ。所述重组猪长效干扰素γ可显著提高猪干扰素的半衰期，较普通猪干扰素γ的半衰期提高13倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高猪自身的免疫应答。

Recombinant porcine long-acting interferon gamma and preparation of fusion protein of this long-acting interferon gamma and preparation method thereof

The invention discloses a fusion protein and preparation method of recombinant porcine interferon gamma and the preparation of long-acting interferon gamma, the fusion protein from porcine interleukin 2 and porcine interferon gamma connected and formed by flexible linker fusion protein and cryoprotector mixed after freeze-drying to obtain recombinant pig interferon gamma. The recombinant porcine long-acting interferon gamma can significantly improve the half-life of interferon in pigs, increase the half-life of interferon gamma by more than 13 times, and has broad spectrum antiviral effect, and can improve the pig's own immune response.

【技术实现步骤摘要】
一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法
本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
近年来规模化集约化猪场在我国迅速兴起,我国生猪存栏量和猪肉生产总量稳居世界首位，传统的猪病防治方法已远不能适应大规模集约化养猪生产中传染病的控制。我国近20年来新出现了近20种畜禽传染病，加上原有的动物疫病，对我国养殖业造成了巨大的经济损失。据不完全统计，我国每年因各种病毒性疾病引起畜禽死亡率高达15％-20％，经济损失达数十亿元。目前对猪病毒性疾病的预防和治疗途径主要是通过疫苗接种和使用抗生素，但由于养殖环境不完善，病毒变异以及机体抵抗力变化等原因，使传统的预防和治疗途径受到了巨大挑战，大部分抗生素类药物以及传统的口服抗病毒药物，由于药物残留问题，给健康带来负面影响；而传统的疫苗，由于它的高特异性以及副作用，无法抵抗病毒变异和新型病毒不断出现给猪养殖业带来的巨大危害。IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥作用的不同，分为γ、β、γ三类。现已知，γ型IFN是由激活的T细胞和NK细胞产生，具有较强抗病毒和免疫调节功能。大量研究表明，干扰素γ除了具有广谱抗病毒功能外，对免疫系统也起着关键的调节作用，所以IFN-γ又称为免疫调节干扰素。虽然各种类型的干扰素均能够介导细胞对病毒感染的反应，但干扰素γ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用，因此干扰素γ具有极为重要的临床应用价值。细胞因子IL-2即白细胞介素2，又名T细胞生长因子。主要由活化的T淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，既可以促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在兽医中，由于IL-2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，也出现广阔的应用前景。IL-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，IL-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。IL-2与其他细胞因子根据基因构建，组成融合蛋白，以增强疫苗的抗体产生和提高细胞免疫水平。天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于临床上应用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法，所述重组猪长效干扰素γ可显著提高猪干扰素的半衰期，较普通猪干扰素γ的半衰期提高13倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高猪自身的免疫应答。本专利技术采取的技术方案为：一种由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCELISTING400〈1〉所示，记为融合蛋白1；或如SEQUENCELISTING400〈2〉所示，记为融合蛋白2。本专利技术还提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈3〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCELISTING400〈4〉所示，记为基因组2。所述基因组1可编码所述融合蛋白1；所述基因组2可编码融合蛋白2。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0时被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现猪IL-2和IFN-γ原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.23、0.24，GC百分比为38.7％、39.2％；而通过对猪IL-2和IFN-γ基因优化后得到重组基因基因组2在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.97、1.0，GC百分比47.6％、45.4％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。本专利技术还提供了含有基因组1或基因组2的表达载体。进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体。本专利技术还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。进一步地，所述基因工程菌为pET-32a/rIL2-IFNγ。含有基因组1或基因组2的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围，进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，更进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。本专利技术还提供了一种重组猪长效干扰素γ，所述重组猪长效干扰素γ由所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/LPBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。本专利技术还公开了所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有基因组1或基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体；所述基因工程菌为pET-32a/rIL2-IFNγ，其制备方法为：(1)设计引物，通过反转录得到或者人工合成连接有柔性linker序列的猪白细胞介素2和猪干扰素γ的目的基因；通过柔性linker将猪白细胞介素2和猪干扰素γ的目的基因连接起来，目的基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈3〉所示或如SEQUENCELISTING400〈4〉所示；(2)将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；(3)将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pET-32a/rIL2-IFNγ。所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号为V205。所述基因组1的获取方法为：a.引物设计猪白细胞介素2(IL-2)的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示，记为融合蛋白1；或如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，记为融合蛋白2。

【技术特征摘要】
1.一种由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCELISTING400〈1〉所示，记为融合蛋白1；或如SEQUENCELISTING400〈2〉所示，记为融合蛋白2。2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈3〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCELISTING400〈4〉所示，记为基因组2。3.含有如权利要求2所述基因的表达载体。4.含有如权利要求2所述基因的基因工程菌。5.一种重组猪长效干扰素γ，其特征在于，所述重组猪长效干扰素γ由权利要求1所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。6.根据权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将权利要求3所述的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为pET...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，韩国祥，赵雨，高耀辉，戚仕梅，马腾飞，周炜，程正阳，
申请(专利权)人：安徽九川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34