一种猪流行性腹泻病毒变异株培养方法及应用技术

本发明专利技术提供一株猪流行性腹泻病毒变异株培养方法，包括有以下步骤：步骤一，样品制备及检测：首先制备组织悬浊液再制备组织病毒液，再对组织病毒液依次进行病毒总RNA的提取

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒变异株培养方法及应用


[0001]本专利技术涉及猪流行性腹泻病毒领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒变异株培养方法及应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻，由猪流行性腹泻病毒引起的一种接触性肠道传染病，其他类传染病、寄生虫病，其特征为呕吐、腹泻、脱水。临床变化和症状与猪传染性胃肠极为相似。与其它冠状病毒相比，猪流行性腹泻病毒（PEDV）适应细胞培养难度很高，所以自70年代初发现以来，许多学者先后以BHK细胞、猪肾细胞、牛睾丸细胞等多种细胞进行分离培养，但一直没有获得成功。直到1988年Hoffman通过培养液加胰酶的方法使PEDV适应了Vero细胞，才开始报道其在Vero细胞上的培养特性，对PEDV的研究开始进入高潮。1999年，日本学者用Vero细胞、MA104细胞、未喂初乳的仔猪膀胱上皮细胞（SB1、SB2）、未喂初乳的仔猪肾细胞(SK)做PEDV接种细胞实验。现有技术专利CN105400744A 公开了一株猪流行性腹泻病毒变异毒株及其分离培养方法和应用，依次进行病料的采集与处理
‑
>病料的RT
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株猪流行性腹泻病毒变异株培养方法，其特征在于，包括有以下步骤：步骤一，样品制备及检测：首先制备组织悬浊液再制备组织病毒液，再对组织病毒液依次进行病毒总RNA的提取
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病毒总cDNA的合成
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基因片段的PCR扩增检测；步骤二：PEDV的分离培养：首先对准备的Vero细胞的进行复苏与培养；之后取步骤一PCR鉴定为阳性的组织悬浊液以12000rpm/min离心10min，取上清加入双抗：青霉素0.1
µ
g/mL和链霉素0.1
µ
g/mL，并以0.22
µ
m无菌滤膜过滤除菌，得到病毒液；再对Vero细胞和病毒液进行病毒的分离培养。2.如权利要求1所述一种猪流行性腹泻病毒变异株培养方法，其特征在于，所述步骤一样品制备包括：取组织样品，使用眼科剪剪碎后置于匀浆器内充分碾磨，然后按1：5的比例加入无菌PBS制为组织悬浊液，反复冻融三次后5000r/min，4℃离心10min取上清液，即为组织病毒液，放于
‑
70℃保存备用。3.如权利要求2所述一种猪流行性腹泻病毒变异株培养方法，其特征在于，所述病毒总RNA的提取包括：(1)取400
µ
l组织病毒液，加入1mlTrizol裂解液，剧烈震荡30s后室温静置10min；(2)加入200
µ
l氯仿，上下颠倒10~20次混匀后室温静置10min，12000r/min离心10min；(3)小心吸取上清液至新EP管中，然后加入1倍体积的异丙醇，
‑
20℃静置15min后12000r/min离心10min；(4)倒掉上清液，加入1ml75%冰乙醇清洗沉淀，上下颠倒5~10次后，静置5min，12000r离心5min；(5)弃上清，倒置EP管于漂浮板上，室温风干沉淀，直至乙醇完全挥发；(6)将沉淀溶于40
µ
l经过DEPC处理的灭菌水中，得到病毒总RNA。4.如权利要求3所述一种猪流行性腹泻病毒变异株培养方法，其特征在于，所述病毒总cDNA的合成包括：将提取的RNA为模板，按试剂盒的说明书反转录合成cDNA，试剂及其用量如下所示：反转录酶0.5
ꢀµ
L、5
×
Buffer2.5
ꢀµ
L、dNTPs 0.5
ꢀµ
L 、随机游引物0.5
ꢀµ
L、RNA 3
ꢀµ
L、 ddH2O 3.5
µ
L；反应条件：37℃、15min，85℃、5min。5.如权利要求4所述一种猪流行性腹泻病毒变异株培养方法，其特征在于，所述基因片段的PCR扩增检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：单雪芹，韩国祥，凡玉芳，王亚男，华荣凯，
申请(专利权)人：安徽九川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：