一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法，其中，罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒包括螺原体DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MrSpi‑P1、引物MrSpi‑B1、引物MrSpi‑P2、引物MrSpi‑B2、引物MrSpi‑P3和引物MrSpi‑B1；本发明专利技术的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的快速扩增反应体系，不但使得罗氏沼虾螺原体定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒可用于现场检测，具有很高的科研和经济价值。

Rapid detection kit and method for macrobrachiumrosenbergii Spiroplasma visualization

The invention discloses a macrobrachiumrosenbergii Spiroplasma visualization rapid detection kit and method for the rapid detection kit including Spiroplasma DNA extraction reagent and reagent macrobrachiumrosenbergii Spiroplasma visualization, the reagent contained for the detection of Macrobrachium rosenbergii Spiroplasma body by using nucleic acid amplification primer set, the primer set contains a primer MrSpi P1, MrSpi B1 primer primer MrSpi, P2, MrSpi B2 primer primer MrSpi and primer P3, MrSpi B1; rapid diagnostic kit of the invention has established a set of optimized rapid amplification reaction system, but not the Macrobrachium Spiroplasma qualitative detection of more simple and rapid, high specificity and high sensitivity, and the kit can be used for on-site detection, it has very high scientific and economic value.

【技术实现步骤摘要】
一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法
本专利技术属于靶基因片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法。
技术介绍
罗氏沼虾螺原体(MacrobrachiumrosenbergiiSpiroplasma，MrSpi)是一种可引起罗氏沼虾幼体和成虾致死性疾病的病原微生物。其通过鳃、肠道和表皮进入罗氏沼虾体内，在血细胞中寄生和增殖，进而感染结缔组织，引起罗氏沼虾幼体活力和抗病力降低，引起罗氏沼虾成虾肌肉损伤和鳃水肿，进而引起罗氏沼虾幼体和成虾死亡。罗氏沼虾螺原体是我国新近发现并在罗氏沼虾苗种中流行的新病原，该病原广泛存在于水产养殖环境中，已在多种虾类中被发现。根据流行病学调查，罗氏沼虾螺原体在罗氏沼虾育苗和养殖期间具有很高的感染风险。专利一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒(申请号：200710025337.8，申请日：2007-07-24，公开号：CN101105494A，公开日：2008-01-16)是一种利用免疫学原理进行设计的检测试剂盒，存在检测步骤封锁且灵敏度低的缺陷；专利虾蟹螺原体病原的原位杂交检测探针及试剂盒(申请号：201210443870.7，申请日：2012.11.08，公开号：CN103805680A，公开日：2014.05.21)是一种利用核酸杂交原理进行设计的检测试剂盒，存在对操作人员要求高、步骤繁琐、检测失败率高等缺点。因此，研制一种操作简便、临床实用、检测灵敏度和特异性高的罗氏沼虾螺原体检测试剂盒，具有重要应用经济价值和市场前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法，本专利技术的试剂盒特异性强，敏感性高；本专利技术罗氏沼虾螺原体快速检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MrSpi-P1、引物MrSpi-B1、引物MrSpi-P2、引物MrSpi-B2、引物MrSpi-P3和引物MrSpi-B3；所述的引物MrSpi-P1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述的引物MrSpi-B1的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述的引物MrSpi-P2的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述的引物MrSpi-B2的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；所述的引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述的引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。本专利技术还公开了一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒，包括螺原体DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有上述的用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组。进一步地，所述螺原体DNA提取试剂的成分为60mMTris、800mMNaCl、20mMEDTA、1％体积百分比NP-40的pH8.0的裂解液。进一步地，所述反应试剂包括以下组分：a)预反应液：20mMpH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mMdNTP、0.5M甜菜碱、0.2μM引物MrSpi-P1、0.2μM引物MrSpi-B1、1.6μM引物MrSpi-P2、1.6μM引物MrSpi-B2、0.8μM引物MrSpi-P3和0.8μM引物MrSpi-B3；所述的引物MrSpi-P1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述的引物MrSpi-B1的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述的引物MrSpi-P2的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述的引物MrSpi-B2的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；所述的引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述的引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；b)反应酶：每微升含8个活性单位的Bst2.0DNA聚合酶；c)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；d)反应显色液：含有10％SYBRGreenI的荧光染料。本专利技术还公开了一种利用上述的罗氏沼虾螺原体的快速检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：1)DNA抽提：取罗氏沼虾幼体或苗或肠道或肝胰脏组织30-80mg于2mL离心管中，采用上述的螺原体DNA提取试剂进行DNA提取；2)对罗氏沼虾螺原体基因进行扩增；3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。进一步地，步骤1)中的DNA抽提具体为：取罗氏沼虾幼体或苗或肠道或肝胰脏组织30-80mg于1.5mL离心管中，并向离心管加入上述的螺原体DNA提取试剂200μL，于冰上用研磨棒研磨，研磨均匀后，95℃以上加热10分钟左右，10000rpm离心10分钟后，上清即为待检DNA模板，-80℃保存备用。进一步地，步骤2)中对罗氏沼虾螺原体基因进行扩增具体为：2.1)根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；2.2)吸取预反应液的体积为N×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；2.3)向设定的N个反应管中分别加入23uL步骤2.2)得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各2uL；2.4)在上述步骤2.3)得到的反应管中再分别加入30uL反应封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；2.5)在65℃下恒温反应50分钟。进一步地，所述的阳性对照为含有罗氏沼虾螺原体基因的质粒，所述的阴性对照为无核酸去离子水。进一步地，步骤3)中显色检测具体为：取出经步骤2.2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入luL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术根据筛选的螺原体细胞分裂蛋白基因作为靶基因，进行特异检测用引物组设计，设计了针对六个结合区的4条引物，只有六个结合区都能完全结合，整个反应才能顺利进行，这增强了反应的高度特异性；此外还设计了两条环引物，可以将扩增反应速度增加至少一倍以上，同时也增加了反应的灵敏度，仅需12个基因拷贝30分钟就可以观察到反应体系的颜色变化；2)本专利技术的快速诊断试剂盒在恒温条件下反应，并通过肉眼可见的颜色变化来判断结果，这使得试剂盒的使用软硬件条件简单，可以避免其它生化试剂对人体的危害；3)本专利技术的快速诊断试剂盒还可通过肉眼观察复印产生的副产物——焦磷酸镁沉淀来判断结果，避免了反应产物开盖对环境的污染；4)本专利技术的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的可以通过肉眼判断结果的等温扩增反应体系，不但使得罗氏沼虾螺原体定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测罗氏沼虾螺原体的第一个可视化检测试剂盒，填补了罗氏沼虾螺原体无快速检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组，其特征在于，该引物组包含引物MrSpi‑P1、引物MrSpi‑B1、引物MrSpi‑P2、引物MrSpi‑B2、引物MrSpi‑P3和引物MrSpi‑B3；所述的引物MrSpi‑P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的引物MrSpi‑B1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的引物MrSpi‑P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述的引物MrSpi‑B2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述的引物MrSpi‑P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述的引物MrSpi‑B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组，其特征在于，该引物组包含引物MrSpi-P1、引物MrSpi-B1、引物MrSpi-P2、引物MrSpi-B2、引物MrSpi-P3和引物MrSpi-B3；所述的引物MrSpi-P1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述的引物MrSpi-B1的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述的引物MrSpi-P2的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述的引物MrSpi-B2的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；所述的引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述的引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。2.一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包括螺原体DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有权利要求1所述的用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组。3.根据权利要求2所述的罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述螺原体DNA提取试剂的成分为60mMTris、800mMNaCl、20mMEDTA、1％体积百分比NP-40的pH8.0的裂解液。4.根据权利要求2所述的罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述反应试剂包括以下组分：a)预反应液：20mMpH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mMdNTP、0.5M甜菜碱、0.2μM引物MrSpi-P1、0.2μM引物MrSpi-B1、1.6μM引物MrSpi-P2、1.6μM引物MrSpi-B2、0.8μM引物MrSpi-P3和0.8μM引物MrSpi-B3；所述的引物MrSpi-P1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述的引物MrSpi-B1的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述的引物MrSpi-P2的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述的引物MrSpi-B2的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；所述的引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述的引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；b)反应酶：每微升含8个活性单位的Bst2.0DNA聚合酶；c)反应封闭液：由...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘晓艺，蔺凌云，徐洋，袁雪梅，沈锦玉，姚嘉赟，尹文林，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33