耐热性纤维二糖水解酶制造技术

本发明专利技术提供一种耐热性纤维二糖水解酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的纤维二糖水解酶催化区域。(A)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1所表示的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽；(C)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽。

Heat resistant fiber two saccharide hydrolase

The present invention provides a heat-resistant fiber two saccharide hydrolase having a catalytic region of fiber two sugar hydrolase comprising the following (A), (B) or (C). (A) by sequence number 1 said polypeptide amino acid sequence composition; (B) by sequence number 1 said amino acid sequence deletion, at least one amino acid amino acid sequence in the substitution or addition and the formation of the composition, and at least 65 DEG C, and under the condition of pH 6 with phosphoric acid the swelling of microcrystalline cellulose for peptide hydrolysis activity of substrate; and (C) by sequence number represented by a 1 amino acid sequence with more than 80% sequence identity of the amino acid sequences of the composition, and at least 65 C and pH polypeptides with hydrolytic activity with phosphoric acid swelling microcrystalline cellulose as substrate under the condition of 6.

【技术实现步骤摘要】
耐热性纤维二糖水解酶
本专利技术涉及一种耐热性纤维二糖水解酶、编码所述耐热性纤维二糖水解酶的多核苷酸、用于表达所述耐热性纤维二糖水解酶的表达载体、以及整合了所述表达载体的转化体及使用了所述耐热性纤维二糖水解酶的制备纤维素分解产物的方法。本申请要求基于2016年3月28日在日本申请的日本特愿2016-064525号的优先权，并在本文中引用其内容。
技术介绍
除了全球变暖以及大气污染等环境上的问题以外，由于对于原油价格的大幅度上升以及不久将来的原油枯竭的预测(石油峰值)等运输用能源供给的担忧，近年来，开发代替石油的能源成为非常重要的课题。植物生物质或木质纤维素是地球上最丰富的可再生能源，其作为代替石油的资源而备受期待。植物生物质干重的主要构成要素为由纤维素或半纤维素等多糖类与木质素构成的木质纤维素。例如，多糖类，在通过作为糖苷水解酶的纤维素酶或半纤维素酶而被水解为葡萄糖或木糖等单糖后，可被用作生物燃料或化学产品的原料。木质纤维素具有复杂的结构，为难分解性，以单一的糖苷水解酶难以分解、糖化(水解(hydrolysis))。在木质纤维素的全分解中，通常认为需要内切葡聚糖酶(纤维素酶或内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、EC3.2.1.4)、外切型的纤维二糖水解酶(1,4-β-纤维二糖苷酶(cellobiosidase)或纤维二糖水解酶、EC3.2.1.91、EC3.2.1.176)、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)这三种酶，此外还需要适当添加还包含作为半纤维素酶的木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶、EC3.2.1.8)或β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)等其他植物细胞壁分解酶的多种酶。在以往的将木质纤维素作为资源的生物乙醇的制备中，以乙醇的高能量效率转化为目的，尝试了利用高固相含量(solidloading)(30～60％固相含量)进行的糖化处理(水解处理(hydrolysisprocess))。这种利用高固相含量进行的木质纤维素的酶糖化(酶水解(enzymatichydrolysis))，其生物质糖化液(生物质水解液(hydrolyzedbiomasssolution))的粘性高，难以进行木质纤维素的水解反应。于是，通过使用耐热性酶，在例如65℃以上的高温下进行酶糖化处理，由此提高水解反应速度，同时降低生物质糖化液的粘性，因此预期能够实现缩短糖化反应时间(水解反应时间(hydrolysisreactiontime))及削减酶量。因此，关于各种糖苷水解酶，期望开发出耐热性更优异的酶。若纤维素通过纤维二糖水解酶被水解，则主要生成二糖的纤维二糖。已知纤维二糖水解酶中存在由纤维素的还原末端进行水解的类型(属于GH7、GH48家族等的纤维二糖水解酶)、由非还原末端进行水解的类型(属于GH5、GH6、GH9家族等的纤维二糖水解酶)，若两者混合使用，则与分别单独使用时相比，纤维素的分解活性上升(例如，参照非专利文献1)。关于由纤维素的非还原末端进行水解的纤维二糖水解酶，在GH6家族中，报导有最适温度超过75℃的纤维二糖水解酶(例如，参照专利文献1)。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2014/157492号非专利文献非专利文献1：Boisset等,《应用与环境微生物学(AppliedandEnvironmentalMicrobiology)》，2000年，第66卷，第1444-1452页。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题本专利技术的目的在于，提供一种至少在65℃、进一步在钙离子的存在下时在70℃下表现纤维二糖水解酶活性、进一步表现与GH6家族的纤维二糖水解酶的协同效应的、属于GH48家族的新型耐热性纤维二糖水解酶、编码所述耐热性纤维二糖水解酶的多核苷酸、用于表达所述耐热性纤维二糖水解酶的表达载体、整合了所述表达载体的转化体及使用了所述耐热性纤维二糖水解酶的制备纤维素分解产物的方法。解决技术问题的技术手段本专利技术的专利技术人们为解决上述问题，通过从堆肥培养物中提取DNA，对分离困难的微生物菌群进行大规模的基因组测序，成功取得了具有新的氨基酸序列的耐热性纤维二糖水解酶，从而完成本专利技术。即，本专利技术的耐热性纤维二糖水解酶、多核苷酸、表达载体、转化体、制备耐热性纤维二糖水解酶的方法、纤维素酶混合物及纤维素分解产物的制备方法，包含下述[1]～[12]的实施方式。[1]一种耐热性纤维二糖水解酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的纤维二糖水解酶催化区域：(A)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1所表示的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素(phosphoricacidswollenAvicel)为底物的水解活性的多肽；(C)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽。[2]根据所述[1]的耐热性纤维二糖水解酶，其中，在钙离子的存在下，至少在70℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性。[3]一种多核苷酸，其具有由下列(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的碱基序列构成的编码纤维二糖水解酶催化区域的区域：(a)编码由序列号1所表示的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；(b)编码由序列号1所表示的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；(c)编码由与序列号1所表示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；(d)编码与序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性的、且至少在65℃、pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；(e)为在严格条件下与序列号2所表示的碱基序列构成的多核苷酸进行杂交的多核苷酸的碱基序列，且为编码至少在65℃、pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列。[4]根据所述[3]的多核苷酸，其中，所述多肽进一步在钙离子的存在下，至少在70℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性。[5]一种表达载体，其整合了所述[3]或[4]的多核苷酸，其在宿主细胞中，能够表达具有纤维二糖水解酶活性的多肽。[6]一种转化体，其导入有所述[5]的表达载体。[7]根据所述[6]的转化体，其为真核微生物。[8]一种制备耐热性纤维二糖水解酶的方法，其包括：在所述[6]或[7]的转化体内，生产耐热性纤维二糖水解酶。[9]一种糖苷水解酶混合物，其含有：所述[1]或[2]所述的耐热性纤维二糖水解酶、所述[3]或[4]所述的多核苷酸编码的耐热性纤维二糖水解酶、或利用所述[8]所述的制备耐热性纤维二糖水解酶的方法制备的耐热性纤维二糖水解酶，及至少一种其他糖苷水解酶。[10]根据所述[9]所述的糖苷水解酶混合物，其进一步含有GH6家族的纤维二糖水解酶。[11]一种制备纤维素分解产物的方法，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐热性纤维二糖水解酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的纤维二糖水解酶催化区域：(A)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1所表示的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽；(C)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽。

【技术特征摘要】
2016.03.28 JP 2016-0645251.一种耐热性纤维二糖水解酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的纤维二糖水解酶催化区域：(A)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1所表示的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽；(C)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽。2.根据权利要求1所述的耐热性纤维二糖水解酶，其中，在钙离子的存在下，至少在70℃、且pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性。3.一种多核苷酸，其具有由下列(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的碱基序列构成的编码纤维二糖水解酶催化区域的区域：(a)编码由序列号1所表示的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；(b)编码由序列号1所表示的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；(c)编码由与序列号1所表示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列所构成、且至少在65℃、pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；(d)编码与序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性的、且至少在65℃、pH为6的条件下具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；(e)为在严格条件下与...

【专利技术属性】
技术研发人员：大熊二郎，须田汀，山口明日香，广濑佳嗣，近藤康弘，佐藤大，柴田大辅，
申请(专利权)人：本田技研工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP