一种噬菌蛭弧菌冻干粉的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种存活率高、粉末状的噬菌蛭弧菌冻干制剂的生产方法，包括按照噬菌蛭弧菌的常规培养方法获得菌液，或者将有害宿主分离后的噬菌蛭弧菌菌悬液；配制保护剂溶液；将待冻干混合液的冷冻干燥后，反复抽真空，冲惰性气体，使得制剂最终变成粉末状；将上述噬菌蛭弧菌冻干粉制剂在真空条件下或者填充惰性气体的条件下进行密封包装，制得噬菌蛭弧菌冻干粉制剂成品。通过多种冻干保护剂的复配，提高了蛭弧菌的冻干存活率，而且噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的性状为粉末状，有利于冻干粉制剂的分散与复配。

【技术实现步骤摘要】
一种噬菌蛭弧菌冻干粉的制备方法
本专利技术属于生物制剂领域，具体涉及一种噬菌蛭弧菌冻干粉的制备方法。
技术介绍
利用生物工程技术来预防和治疗动物细菌性疾病已被人们广泛使用。特别是蛭弧菌的应用受到人们越来越多的关注。由于噬菌蛭弧菌主要裂解革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、弧菌等革兰氏阴性致病菌，且对人和动物无害，相较于传统的物理化学抗生素消除致病菌有明显的优势。传统的物理化学抗生素在消灭有害病菌上存在着明显的弊端，物理方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节，不能实现整个领域的覆盖。化学以及抗生素方法经长期使用后致病菌容易形成抗逆性，降低使用效果，同时也破坏抑制了有益菌群，存在潜在的环境危害，最终不能有效地控制、消除致病菌。所以，噬菌蛭弧菌已经逐渐广泛应用于水产养殖中水体治理，鱼虾蟹中弧菌的预防与治疗，以及鸡鸭类肠道疾病的控制。由于噬菌蛭弧菌不生成芽孢，对环境要求苛刻，其存活的环境温度为4～45℃，现在使用的噬菌蛭弧菌的生物制剂是液体生物制剂。由于在液态制剂中，随着自身菌的不断生长繁殖，会导致液态机制中的新陈代谢产物不断积累，pH值逐渐变化，杂菌也会日益增值。同时，当环境温度高于25℃，液态制剂中的噬菌蛭弧菌的活菌数迅速衰减，其疗效也迅速下降，因此，液体制剂在常温下的保质期只有三、四个月左右，严重影响了该生物制品的推广应用。因此，人们开始将蛭弧菌进行冻干制备成冻干粉以便于长期的保存。现有专利(申请号99112389.1)将噬菌蛭弧菌(活菌体)与粪链球菌的活菌体混合制备成菌悬液，在将制备好的菌悬液与保护剂按一定比例混合，其保护剂为蔗糖与明胶组合或者蔗糖与脱脂奶粉的组合。再将混合液进行预冻、升华、解析后得到冻干粉，其蛭弧菌在冻干后损失近一个数量级，存活率为50～70％之间。该专利的保护剂成分简单，冻干粉噬菌蛭弧菌存活率不高，为50～70％。同时，没有公开具体冻干工艺，缺乏具体的操作指导。最后宿主为粪链球菌，宿主种类单一，对于蛭弧菌的保存效果一般。现有专利(申请号00112230.4)阐述了一种宿主为死宿主的冻干制备方法。噬菌蛭弧菌按照灭活宿主培养方法制成菌液，获得噬菌蛭弧菌水剂。将噬菌蛭弧菌水剂与稳定剂混合，获得冻干混合液，进行冷冻干燥。其中其冻干保护剂为脱脂奶粉蔗糖稳定剂，冷冻干燥的温度为-50℃～37℃。预冻温度为-20～-50℃。但是，噬菌蛭弧菌宿主为致死的福氏志贺氏痢疾菌或者是大肠杆菌。使用灭活的宿主培养的蛭弧菌其侵染能力较弱，同时使用氯仿进行灭活存在潜在的环境危害，同时宿主为福氏贺氏痢疾菌或大肠杆菌均具有较强的致病性，如果灭活不彻底对环境具有强大的破坏性。同时，冻干保护剂组分简单，专利中未提及冻干存活率是多少，冻干效果未知，存在明显的不确定性，缺乏参考性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种存活率高、粉末状的噬菌蛭弧菌冻干制剂的生产方法，包括以下步骤：a.噬菌蛭弧菌菌悬液的获得：按照噬菌蛭弧菌的常规培养方法获得菌液，宿主为无致病性的革兰氏阴性菌，或者是将有害宿主分离后的噬菌蛭弧菌菌悬液；b.保护剂溶液的配制：将保护剂溶液与所述步骤a的噬菌蛭弧菌菌悬液按照1：1体积比例混合，制得噬菌蛭弧菌待冻干混合液；c.待冻干混合液的冷冻干燥：将所述噬菌蛭弧菌待冻干混合液放置于真空冷冻干燥器中进行真空冷冻干燥，获得噬菌蛭弧菌冻干制剂；d.将块状的冻干制剂进行反复抽真空，冲惰性气体，使得制剂最终变成粉末状；e.将上述噬菌蛭弧菌冻干粉制剂在真空条件下或者填充惰性气体的条件下进行密封包装，制得噬菌蛭弧菌冻干粉制剂成品。优选地，本专利技术所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法中，所述步骤a无致病性宿主为：枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸链球菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌或戊糖片球菌的一种或几种。优选地，本专利技术所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法中，所述步骤a的噬菌蛭弧菌菌悬液为含有无致病性的革兰氏阴性菌的噬菌蛭弧菌菌悬液。优选地，本专利技术所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法中，所述无致病性革兰氏阴性菌来源为宿主本身或通过人工添加获得，最终噬菌蛭弧菌与无致病性的革兰氏阴性菌数量比例为：1:10～1：100。优选地，本专利技术所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法中，所述的无致病性的革兰氏阴性菌为枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸链球菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌或戊糖片球菌的一种或几种。优选地，本专利技术所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法中，所述步骤b的保护剂溶液配制方法为，使用灭菌的纯化水分别溶解脱脂奶粉、β-环糊精、海藻糖、甘露醇、天门冬氨酸，使得其最终质量浓度分别为2％～10％，2％～10％，2％～4％、2％～6％、2％～8％。优选地，本专利技术所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法中，所述步骤c中噬菌蛭弧菌菌悬液与保护剂溶液的混合体积比为1:1～1:2。优选地，本专利技术所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法中，所述步骤d对所述冻干制剂处理的参数为预冻温度为-30～-20℃，预冻时间为2～5小时，冷冻干燥过程温度范围为-15～37℃，真空范围为0.05毫巴～0.2毫巴，冻干时间为24～48小时。优选地，本专利技术所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法中，所述步骤d中对所述块状的冻干制剂的性状为：疏松的块状结构，含水量为1～5％，存活率大于85％。本专利技术的另一目的在于提供上述方法获得的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂。本专利技术与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1)、本专利技术通过多种冻干保护剂的复配，提高了蛭弧菌的冻干存活率。2)、其次，本专利技术的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的性状为粉末状，有利于冻干粉制剂的分散，即：根据实际使用需要，通过其他粉末进行噬菌蛭弧菌粉制剂稀释，已达到更好的使用效果。3)最后，通过添加有益生态环境的宿主，不仅提高了冻干粉中噬菌蛭弧菌蛭弧菌复苏的速度以及稳定性。同时，在实际的生产应用中也发挥了积极的作用，不仅没有潜在的环境危害，而且还有利于环境的保护。具体实施方式在本专利技术的一个实施例中，提供了噬菌蛭弧菌冻干制剂的生产方法，包括以下步骤：a.噬菌蛭弧菌菌悬液的获得：按照噬菌蛭弧菌的常规培养方法获得菌液，宿主为无致病性的革兰氏阴性菌，或者是将有害宿主分离后的噬菌蛭弧菌菌悬液；b.保护剂溶液的配制：将保护剂溶液与所述步骤a的噬菌蛭弧菌菌悬液按照1：1体积比例混合，制得噬菌蛭弧菌待冻干混合液；c.待冻干混合液的冷冻干燥：将所述噬菌蛭弧菌待冻干混合液放置于真空冷冻干燥器中进行真空冷冻干燥，获得噬菌蛭弧菌冻干制剂；d.将块状的冻干制剂进行反复抽真空，冲惰性气体，使得制剂最终变成粉末状；e.将上述噬菌蛭弧菌冻干粉制剂在真空条件下或者填充惰性气体的条件下进行密封包装，制得噬菌蛭弧菌冻干粉制剂成品。优选地，在本专利技术的另一个实施例中，所述步骤a中的无致病性宿主为：枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸链球菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌或戊糖片球菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种噬菌蛭弧菌冻干制剂的生产方法，包括以下步骤：a.噬菌蛭弧菌菌悬液的获得：按照噬菌蛭弧菌的常规培养方法获得菌液，宿主为无致病性的革兰氏阴性菌，或者是将有害宿主分离后的噬菌蛭弧菌菌悬液；b.保护剂溶液的配制：将保护剂溶液与所述步骤a的噬菌蛭弧菌菌悬液按照1：1体积比例混合，制得噬菌蛭弧菌待冻干混合液；c.待冻干混合液的冷冻干燥：将所述噬菌蛭弧菌待冻干混合液放置于真空冷冻干燥器中进行真空冷冻干燥，获得噬菌蛭弧菌冻干制剂；d.将块状的冻干制剂进行反复抽真空，冲惰性气体，使得制剂最终变成粉末状；e.将上述噬菌蛭弧菌冻干粉制剂在真空条件下或者填充惰性气体的条件下进行密封包装，制得噬菌蛭弧菌冻干粉制剂成品。

【技术特征摘要】
1.一种噬菌蛭弧菌冻干制剂的生产方法，包括以下步骤：a.噬菌蛭弧菌菌悬液的获得：按照噬菌蛭弧菌的常规培养方法获得菌液，宿主为无致病性的革兰氏阴性菌，或者是将有害宿主分离后的噬菌蛭弧菌菌悬液；b.保护剂溶液的配制：将保护剂溶液与所述步骤a的噬菌蛭弧菌菌悬液按照1：1体积比例混合，制得噬菌蛭弧菌待冻干混合液；c.待冻干混合液的冷冻干燥：将所述噬菌蛭弧菌待冻干混合液放置于真空冷冻干燥器中进行真空冷冻干燥，获得噬菌蛭弧菌冻干制剂；d.将块状的冻干制剂进行反复抽真空，冲惰性气体，使得制剂最终变成粉末状；e.将上述噬菌蛭弧菌冻干粉制剂在真空条件下或者填充惰性气体的条件下进行密封包装，制得噬菌蛭弧菌冻干粉制剂成品。2.根据权利要求1所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法，其特征在于，所述步骤a无致病性宿主为：枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸链球菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌或戊糖片球菌的一种或几种。3.根据权利要求1所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法，其特征在于，所述步骤a的噬菌蛭弧菌菌悬液为含有无致病性的革兰氏阴性菌的噬菌蛭弧菌菌悬液。4.根据权利要求3所述的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂的生产方法，其特征在于，所述无致病性革兰氏阴性菌来源为宿主本身或通过人工添加获得，最终噬菌蛭弧菌与无致病性的革兰氏阴性菌数量...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭立，敬科举，林茂，
申请(专利权)人：厦门昶科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35