单细胞RNA和突变分析PCR(SCRM‑PCR)：用于在单细胞水平上同时分析DNA和RNA的方法技术

一种同时分析样品中的RNA和DNA的方法，所述方法包括步骤(a)使所述样品与来自第一引物对的指向靶RNA区域的反向引物接触，以实现通过逆转录酶将RNA逆转录为cDNA；(b)随后使所述样品与(i)来自所述第一引物对的指向第二cDNA区的正向引物、(ii)来自第二引物对的靶向DNA区域的正向引物和反向引物和(ii)DNA聚合酶接触，以同时扩增所述靶cDNA和靶DNA区域；和(c)分析所扩增的靶cDNA区域和/或所扩增的靶DNA区域。还涵盖所述方法用于分析基因表达和突变的用途、试剂盒，所述试剂盒包含引物、酶、缓冲液。

Single cell RNA and mutation analysis of PCR (SCRM PCR): for the simultaneous analysis of DNA and RNA in single cell level

A method for simultaneous analysis of samples of RNA and DNA, the method includes the steps of (a) and the sample from the first primer pair to reverse primer contact target RNA region, to achieve through reverse transcriptase reverse transcriptase RNA cDNA (b); then the samples with positive (I) primers from the first primer to cDNA District second, (II) from second primers targeting the DNA region of the forward and reverse primers and DNA polymerase (II) contact to the simultaneous amplification of target cDNA and target DNA region; and (c) analysis of the amplified target area and cDNA the amplified DNA / or target area. The invention also relates to the use of the method for analyzing gene expression and mutation, and the kit comprises primers, enzymes and buffers.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单细胞RNA和突变分析PCR(SCRM-PCR)：用于在单细胞水平上同时分析DNA和RNA的方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年1月21日提交的新加坡专利申请号10201500472R的优先权的权益，该新加坡专利申请的内容在此以引用方式整体并入，用于所有目的。
本专利技术大体上涉及聚合酶链式反应(PCR)。具体地说，本专利技术涉及同时分析RNA和DNA的方法。
技术介绍
1983年由KaryMullis开发的聚合酶链式反应(PCR)技术提供了快速扩增少量特定靶DNA的方法。扩增的DNA可用于促进对于存在DNA序列变异、突变、限制性酶切割或寡核苷酸对的连接的分析。PCR已成为在医学和生物研究实验室中广泛应用的一种常见的且经常不可缺少的工具。这些应用中的一些越来越指向需要将特定的DNA谱与其基因表达相关联。例如，已变得越来越有用的是，确定在血流中循环的癌细胞的突变，并且将该特异性DNA谱与其基因表达相关联以确定所述细胞的类型和来源，以便促进各种人癌症的诊断、预后、预防和治疗。对临床样品或其它样品如法医样品的此类分析的一个问题在于所述样品经常含有低数目的细胞(如1-100个细胞)，或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时分析样品中的RNA和DNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述样品与来自第一引物对的反向引物和逆转录酶接触，以实现将所述RNA逆转录为cDNA，来自所述第一引物对的所述反向引物指向靶RNA区域；(b)随后使所述样品与以下接触：(i)来自所述第一引物对的正向引物，来自所述第一引物对的所述正向引物指向靶cDNA区域，(ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，来自所述第二引物对的所述反向引物和正向引物指向靶DNA区域，和(ⅲ)DNA聚合酶以同时扩增所述靶cDNA区域和所述靶DNA区域；和(c)分析扩增的靶cDNA区域和/或扩增的靶DNA区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.21 SG 10201500472R1.一种同时分析样品中的RNA和DNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述样品与来自第一引物对的反向引物和逆转录酶接触，以实现将所述RNA逆转录为cDNA，来自所述第一引物对的所述反向引物指向靶RNA区域；(b)随后使所述样品与以下接触：(i)来自所述第一引物对的正向引物，来自所述第一引物对的所述正向引物指向靶cDNA区域，(ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，来自所述第二引物对的所述反向引物和正向引物指向靶DNA区域，和(ⅲ)DNA聚合酶以同时扩增所述靶cDNA区域和所述靶DNA区域；和(c)分析扩增的靶cDNA区域和/或扩增的靶DNA区域。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：使用步骤(a)中的所述反向引物或步骤(b)(i)中的所述正向引物和在所述扩增的靶cDNA区域内结合的巢式引物，使来自步骤(b)的所述样品经受半巢式PCR。3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：使用在所述扩增的靶DNA区域内结合的巢式引物，使来自步骤(b)的所述样品经受巢式PCR。4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(a)和(b)在相同的反应混合物中进行。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中同时对于一个或多个靶RNA区域和/或一个或多个靶cDNA区域和/或一个或多个靶DNA区域进行所述方法。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含单细胞或多个细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述单细胞或多个细胞选自由以下组成的组：来自植入前胚胎的细胞、干细胞、疑似癌细胞、疑似肿瘤来源的细胞、疑似胚胎细胞、来自病原生物体的细胞或从犯罪现场获得的细胞。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含无细胞的RNA或无细胞的DNA。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述无细胞的RNA或无细胞的DNA以选自由以下组成的组的量存在：约5pg到约10ng、约5pg到约5ng、约5pg到约1ng、约5pg到约500pg、约5pg到约250pg、约5pg到约125pg、约5pg到约100pg和约5pg到约50pg。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一引物对包含跨越外显子-外显子边界的引物或由相应DNA区域上的至少一个内含子隔开的引物。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中a)所述第一引物对或第二引物对的所述正向引物选自由以下组成的组：SEQIDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85和87；b)所述第一引物对或第二引物对的所述反向引物选自由以下组成的组：SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86和88；或c)所述第一引物对或第二引物对选自由以下组成的组：SEQIDNO1和2；SEQIDNO3和4；SEQIDNO5和6；SEQIDNO7和8；SEQIDNO9和10；SEQIDNO11和12；SEQIDNO13和14；SEQIDNO15和16；SEQIDNO17和18；SEQIDNO19和20；SEQIDNO21和22；SEQIDNO23和24；SEQIDNO25和26；SEQIDNO27和28；SEQIDNO29和30；SEQIDNO31和32；SEQIDNO33和34；SEQIDNO35和36；SEQIDNO37和38；SEQIDNO39和40；SEQIDNO41和42；SEQIDNO43和44；SEQIDNO45和46；SEQIDNO47和48；SEQIDNO49和50；SEQIDNO51和52；SEQIDNO53和54；SEQIDNO55和56；SEQIDNO57和58；SEQIDNO59和60；SEQIDNO61和62；SEQIDNO63和64；SEQIDNO65和66；SEQIDNO67和68；SEQIDNO69和70；SEQIDNO71和72；SEQIDNO73和74；SEQIDNO75和76；SEQIDNO77和78；SEQIDNO79和80；SEQIDNO81和82；SEQIDNO83和84；SEQIDNO85和86；以及SEQIDNO87和88。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二引物对包含与所述靶DNA区域的内含子区域结合的引物。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中a)用于半巢式PCR或巢式PCR的所述正向引物选自由以下组成的组：SEQIDNO:89、90、91、92、93、94、95、15、17、19、99、23、101、102、104、105、106、107、108、110、111、43、45、115、116、117、118、55、120、59、61、123、124、125、126、71、127、75、77、130、81、132、133和134；b)用于半巢式PCR或巢式PCR的所述反向引物选自由以下组成的组：SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、96、97、98、22、100、26、103、30、32、34、36、109、40、112、113、114、48、50、52、54、119、58、121、122、64、66、68、70、72、74、128、129、80、131、84、86和88；或c)用于半巢式PCR或巢式PCR的所述引物选自由以下组成的组：SEQIDNO89和2；SEQIDNO90和4；SEQIDNO91和6；SEQIDNO92和8；SEQIDNO93和10；SEQIDNO94和12；SEQIDNO95和14；SEQIDNO15和96；SEQIDNO17和97；SEQIDNO19和98；SEQIDNO99和22；SEQIDNO23和100；SEQIDNO101和26；SEQIDNO102和103；SEQIDNO104和30；SEQIDNO105和32；SEQIDNO106和34；SEQIDNO107和36；SEQIDNO108和109；SEQIDNO110和40；SEQIDNO111和112；SEQIDNO43和113；SEQIDNO45和114；SEQIDNO115和48；SEQIDNO116和50；SEQIDNO117和52；SEQIDNO118和54；SEQIDNO55和119；SEQIDNO120和58；SEQIDNO59和121；SEQIDNO61和122；SEQIDNO123和64；SEQIDNO124和66；SEQIDNO125和68；SEQIDNO126和70；SEQIDNO71和72；SEQIDNO127和74；SEQIDNO75和128；SEQIDNO77和129；SEQIDNO130和80；SEQIDNO81和131；SEQIDNO132和84；SEQIDNO133和86；以及SEQIDNO134和88。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述分析包括针对基因表达分析所述扩增的靶cDNA。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述分析包括针对突变分析所述扩增的靶DNA。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括约1个到约50个循环步骤。17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(b)包括3个循环步骤。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中每个循环步骤包含约1个到约50个循环的变性、退火和伸长。19.根据权利要求18所述的方法，其中每个循环步骤包含6个循环的变性、退火和伸长。20.根据权利要求18或19所述的方法，其中一个循环中的退火和/或伸长温度为约40℃到约75℃。21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述退火和/或伸长进行约10秒到约10分钟。22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述变性在约75℃到约120℃的温度下进行。23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述变性进行约1秒到约10分钟。24.根据权利要求16-23中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：60℃持续4分钟、之后95℃持续1分钟的6个循环，55℃持续4分钟、之后95℃持续1分钟的6个循环，和50℃持续4分钟、之后95℃持续1分钟的6个循环。25.一种同时分析样品中的RNA和DNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)溶解所述样品中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈民汉，I·西玛，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG