公开了包括引物和探针的组合物，其能够与公开的核酸相互作用，如本文公开的编码HIV的逆转录酶、蛋白酶或整合酶的核酸。因此，提供了包括SEQ ID NOS:1-89、96-122和124-151所示的核苷酸序列中的任何一种的寡核苷酸。还提供了由SEQ ID NOS:1-89、96-122和124-151所示的核苷酸组成的寡核苷酸。所公开的寡核苷酸中的每一种是探针或引物。还提供了引物和探针的混合物并用于本文公开的RT-PCR和初级PCR反应中。提供了用于同时或连续地特异性检测HIV中几个突变的方法。可以使用本文描述的方法检测HIV的逆转录酶、蛋白酶或整合酶中的突变。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测HIV-1对抗病毒药物的抗性的实时PCR点突变分析相关申请的交叉引用本申请依赖于并要求2013年5月31日提交的美国临时申请第61/829,473号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。政府利益本文所描述的专利技术可以由或为美国政府制造、使用并许可。专利技术背景现在HIV流行超过4千万人并且其扩展正面临用于照料那些受感染者生命的抗HIV药物的使用增加。由于用于HIV-1感染人群的临床管理的这些药物的使用在世界范围内增加，预期抗药性的出现增加。含有三种抗逆转录病毒药物组合的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是目前推荐的并且已有效降低死亡率和发病率。四类药物是可利用的：抑制病毒体进入(如，T-20)、通过病毒逆转录酶抑制核苷酸延伸(如3TC、d4T)、抑制逆转录酶酶活性(如，奈韦拉平、依法韦仑)或抑制病毒蛋白酶(如，奈非那韦、洛匹那韦)的药物。突变所赋予的抗药性通常在来自抗逆转录病毒治疗失败的患者的病毒中进行选择，并且被认为是治疗失败的主要原因。目前的治疗方针建议对开始抗逆转录病毒治疗的患者进行最佳用药方案选择的基准耐药测试。对人所携带的任何有抗性(resistant)的病毒的准确识别将有助于指导对使用全活性药物的治疗方案的选择。通过利用表型分析或基因型分析进行耐药测试。表型分析对源于患者的病毒的药物敏感性进行测量，并提供耐药的直接证据。然而，表型分析是基于培养、复杂、费力且成本高的。基因型分析通常用于通过对来自血浆的病毒RNA进行序列分析来检测与耐药相关的突变。这些分析同样是复杂的并且对低水平突变体的检测不敏感，如可能早期存在于抗性的出现中或在缺乏治疗的情况下可能在低设定点处存留的。常用的测序方法并不能可靠地检测以低于样品内总病毒种群量的20-30％的水平存在的突变体。本申请中描述了基于PCR的耐药检测分析，其能够检测受感染者血浆内出以低至0.5％-0.04％的频率存在的耐药病毒。这些敏感度比通过常规序列测试所达到的敏感度高40-500倍。尽管抗药性经常在抗逆转录病毒治疗失败的患者中见到，但在未用药物的群体中发现传播耐药HIV-1的实质患病率(～8-25％)，这支持对基准耐药测试的需要。由于在缺乏药物的情况下抗药性突变体通常比野生型病毒更不适合，所以许多抗药性突变随时间回复至野生型，并且逐渐地变得不能在血浆中检测。然而，在血浆中不能检测的抗药性病毒继续存于患者内，并且当使用药物时被重新选择。因此，具有能够准确检测低频率耐药突变体存在的敏感性分析是重要的。来自使用本专利申请中描述的敏感性实时PCR分析的数据清楚地表明，对未用药物的人的常规测序低估了传播抗药性的患病率(Johnsonetal.,13thHDRWorkshop,Tenerife,Spain,2004)。通过敏感性分析测试附加突变的传播耐药病毒识别出新的突变体，其增加了另外2-8％的群体中的抗性患病率。所述增加暗示以比先前报道高20-80％的频率传播抗药性突变。因此，这些数据证明了用于基准抗药性测试的测序方法的较差灵敏度。抗药性测试还指示用于接收HAART的患者控制治疗失败并有助于指导对具有活性药物的新HAART方案的选择。最近的数据指出对该测试的敏感抗药性分析的重要性并使通过常规测序不能检测的低频率抗药性病毒与差的治疗结果相关联(Mellors等,11thCROI,2004；Jourdainetal.,JID2004)(1)。这些研究报道了，暴露于非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)的人——其产生仅通过敏感性分析可检测的而通过常规测序不可检测到的抗性突变——对随后包括NNRTI的方案响应更差。来自本文报道的C亚型HIV-1分析的数据显示，无法通过常规群体测序对多于三分之一的从分娩期单剂量奈韦拉平干预中出现的抗药性病毒进行识别(Johnsonetal.,12thCROI2005)。对大量低频率耐药病毒的检测将对选择使用完全有活性药物的方案是重要的。在受治疗人群的临床监测中，该实时PCR抗性分析相对于常规测序的更高灵敏度可允许对在治疗过程中出现的抗性突变进行早期检测，并提供响应治疗的可能下降的预先通知。早期检测将有助于指导医生修改给药方案以防止治疗失败和高水平抗药性的出现。在检测低水平抗性病毒中(低于通过常规序列分析能够检测的水平)具有更高敏感度的方法对改善处于HAART的患者的临床管理是重要的。本专利技术实时PCR耐药分析的相当高的灵敏度、简单性、高通量能力和低成本相对于常规测序分析更加具有优势。专利技术概述提供以下专利技术概述以便于理解本专利技术所特有的一些创新性特征，且并不意图完整描述。对专利技术各个方面的全面理解可以通过将整个说明书、权利要求书、附图和摘要作为一个整体考虑而获得。公开了包括引物和探针的组合物以及对生物样品中抗药性HIV进行高灵敏度突变特异性检测的方法，所述引物和探针能够与编码HIV-1的一种或多种蛋白质的核酸——如编码HIV的逆转录酶、蛋白酶或整合酶的核酸——相互作用。因此，本专利技术的第一目的是提供可用于选择性和突变特异性检测HIV-1的一种或多种蛋白质或编码蛋白质(一种或多种)的基因中的突变的组合物。因此，提供了包括SEQIDNOs:142-151中所示的核苷酸序列中的任一种的寡核苷酸。还提供了由SEQIDNOs:142-151中所示的核苷酸序列中的任一种组成的寡核苷酸。所公开的寡核苷酸中的每一种都是探针或引物。还提供了引物的混合物以及引物和探针的混合物并用于本文公开的RT-PCR和初级PCR反应。提供了包括引物或探针的试剂盒。提供了用于特异性检测HIV中若干突变(如赋予抗药性的突变)的方法。可以使用本文所描述的方法检测HIV逆转录酶或蛋白酶中的突变。附图简述图1A和1B是根据本专利技术一些实施方式用于检测一个或多个编码HIV-1逆转录酶或蛋白酶的蛋白质的基因中是否存在一个或多个突变的分析的原理示意图。图2A显示184V的分析灵敏度；图2B显示临床样品中184V检测的下限；图3显示针对临床样品的184V分析的性能；图4显示临床样品的ΔCT频率分布；图5显示在先-NVP和后-NVP血浆样品中103N突变的实时PCR分析的ΔCT值；图6显示检测HIV-1C亚型65R突变的方法的临床和绝对检测限；图7显示检测HIV-1整合酶148R突变的方法的绝对检测限；图8图示使用用于检测扩增产物的嵌入染料突变特异性扩增HIV-1逆转录酶219Q突变；图9A图示使用用于检测扩增产物的嵌入染料突变特异性检测HIV-1蛋白酶中的I50V突变；图9B图示使用包括SEQIDNO:148、为扩增产物的检测提供意料不到增加的特异性的探针突变特异性检测HIV-1蛋白酶中的I50V突变；图10A图示仅使用41L突变的引物组正确识别单重反应中41L突变；图10B图示使用与90M、103N和215Y突变的引物组组合的41L突变的引物组正确识别多重反应中41L突变；图11A图示使用针对所有90M、41L、103N和215Y突变的引物组在多本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于特异性检测HIV‑1的一个或多个基因或蛋白质中存在或不存在一个或多个单核苷酸突变的方法，包括：(a)逆转录从HIV‑1提取的RNA，以生成DNA产物；(b)在适于聚合酶链式反应的条件下使步骤(a)的所述DNA产物与突变特异性引物和反向引物接触，所述突变是在：HIV‑1逆转录酶中，其中所述突变特异性引物包括选自SEQ ID NO:142、143、144、149、150和151的核苷酸序列，HIV‑1蛋白酶中，其中所述突变特异性引物包括选自SEQ ID NO:146的核苷酸序列，或者HIV‑1逆转录酶和HIV‑1蛋白酶中，所述接触同时进行；和(c)通过检测作为步骤(b)的所述接触结果而生成的扩增产物的存在或不存在来检测所述突变的存在或不存在。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.31 US 61/829,4731.突变特异性引物和反向引物在制备用于特异性检测HIV-1的一个或多个基因或蛋白质中存在或不存在一个或多个单核苷酸突变的试剂或试剂盒中的应用，所述检测包括：
（a）逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成DNA产物；
（b）在适于聚合酶链式反应的条件下使步骤（a）的所述DNA产物与突变特异性引物和反向引物接触，所述突变是在：
HIV-1逆转录酶或HIV-1逆转录酶和HIV-1蛋白酶两者中，其中用于HIV-1逆转录酶中的突变的所述突变特异性引物包括选自SEQIDNO:143和149的核苷酸序列，其中用于HIV-1蛋白酶中的突变的所述突变特异性引物包括选自SEQIDNO:146的核苷酸序列，所述接触同时进行；和
（c）通过检测作为步骤（b）的所述接触结果而生成的扩增产物的存在或不存在来检测所述突变的存在或不存在。
2.权利要求1所述的应用，其中所述突变是逆转录酶中的K70E突变，并且所述突变特异性引物包括SEQIDNO:143或SEQIDNO:149的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的应用，其中所述突变是蛋白酶中的I50V突变，并且所述突变特异性引物包括SEQIDNO:146的核苷酸序列。
4.正向引物和包括SEQIDNO:143或SEQIDNO:149的突变特异性反向引物在制备用于检测HIV-1C亚型的逆转录酶中K70E突变的存在或不存在的试剂或试剂盒中的应用，所述检测包括：
（a）逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成DNA产物；
（b）在适于聚合酶链式反应的条件下使步骤（a）的所述DNA产物与正向引物和包括SEQIDNO:143或SEQIDNO:149的突变特异性反向引物接触；和
（c）通过检测作为步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·约翰逊，W·M·海尼恩，J·T·利普斯科姆，X·魏，
申请(专利权)人：美国健康及人类服务部，
类型：发明
国别省市：美国;US
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