用于核酸单克隆簇的产生和测序的方法和阵列技术
Methods and arrays for the generation and sequencing of nucleic acid monoclonal clusters
Method for acquisition and amplification of a target polynucleotide in microarray holes especially on solid surface, wherein the microarray can include a) substrate, the substrate including at least one hole, around the hole surface and internal pore surface; b) the first layer, the first layer covers the inner hole surface and contains at least one first capture primer and C); the second layer, the second layer covering the first layer and the surface around the hole. Optionally, the microarray can include: a) substrate, wherein the substrate comprises at least one hole, around the hole surface and internal pore surface; and b) layer, the layer covering the internal hole surface and comprising at least one first capture primer pair and at least one second primers to capture. In particular, kinetics exclude amplification of monoclonal groups used to produce nucleic acids in pores. The invention also discloses a method for modifying the fixed capture primer, the method comprises the following steps: a) the substrate with a variety of template nucleic acid capture primer contains a variety of fixed contact to produce one or more fixed template nucleic acid, including a variety of fixed capture primers including first several primers and second kinds of primers. The first several primers containing 3 'end general Y capture region such as primer P5, the second kinds of primers containing 3' end universal capture region Z as primer P7; and each kind of common 5 'flanking DNA template end and 3' end of Y or Z capture area, and contains a one or more restriction sites such as SapI and in general one or more restriction sites and 3 'end capture region target specific capture region; and b) one or more extension Multiple fixed capture primers. Finally, the invention discloses a method for fixing the capture modified primer, the method comprises the following steps: a) the basement contains a variety of fixed capture primer and various kinds of seeds with different nucleic acid, to produce a variety of different fixed seed nucleic acid; b) extends two or more fixed primers to capture with a variety of different fixed seed nucleic acid in two or more more complementary of different fixed extension products; and C) a fixed extension product different fixed extension product activation, to form an active capture primer.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸单克隆簇的产生和测序的方法和阵列本申请要求2014年11月11日提交的美国临时申请号62/078,346和2014年12月23日提交的美国临时申请号62/096,464的优先权，这些申请以其整体并入本文。领域本公开内容涉及分子生物学领域，并且更具体地涉及用于在固体表面上捕获和扩增靶多核苷酸的方法。背景下一代测序已经使得能够进行全基因组测序和全基因组分析。下一代测序方法通常依赖于基因组片段的通用扩增，其首先配备通用扩增区域，并且然后在固体表面上通过通用捕获引物不加选择地捕获。通用捕获引物介导多核苷酸捕获和桥式扩增二者，这是下一代测序方法中的有用元素(参见，例如，WO2011/025477A1、US2011/0172119A1)。虽然许多现有的方法能够有效地支持整个基因组的测序，但它们通常不允许特定多核苷酸的靶向捕获，并且因此通常不支持例如部分基因组的靶向测序。然而，对促进例如生物体外显子或转录组的特定部分的靶向测序的方法存在日益增长的需求。这种需求部分由成本驱动，但也受数据处理的考虑驱动。因此，对使得能够实现部分基因组的靶向下一代测序的新方法存在需求。本公开内...
【技术保护点】
一种微阵列，所述微阵列包括：a)基底，所述基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面；b)第一层，所述第一层覆盖所述内部孔表面并包含至少一种第一捕获引物对；以及c)第二层，所述第二层覆盖所述第一层和所述围绕所述孔的表面。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.11 US 62/078,346;2014.12.23 US 62/096,4641.一种微阵列，所述微阵列包括：a)基底，所述基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面；b)第一层，所述第一层覆盖所述内部孔表面并包含至少一种第一捕获引物对；以及c)第二层，所述第二层覆盖所述第一层和所述围绕所述孔的表面。2.根据权利要求1所述的微阵列，其中所述第一层不覆盖所述围绕所述孔的表面。3.根据权利要求1或2所述的微阵列，其中所述第一层至少部分地覆盖所述内部孔表面。4.根据权利要求1至3所述的微阵列，其中所述至少一个孔是多个孔。5.根据权利要求4所述的微阵列，其中所述多个孔以约700nm的间距隔开。6.根据权利要求1至5所述的微阵列，其中所述孔的直径小于约1μm。7.根据权利要求6所述的微阵列，其中所述孔的直径在约30nm和约900nm之间。8.根据权利要求7所述的微阵列，其中所述孔的直径在约100nm和约400nm之间。9.根据权利要求8所述的微阵列，其中所述孔的直径为约400nm。10.根据权利要求1至9所述的微阵列，其中所述第一层包含聚合物涂层。11.根据权利要求10所述的微阵列，其中所述聚合物涂层包含聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(PAZAM)。12.根据权利要求1至11所述的微阵列，其中所述第二层包含聚合物涂层。13.根据权利要求12所述的微阵列，其中所述聚合物涂层包含PAZAM或无硅烷丙烯酰胺(SFA)。14.根据权利要求1至13所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对。15.根据权利要求1至14所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。16.根据权利要求15所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对的第一引物包含引物核苷酸序列，并且所述至少一种第一捕获引物对的第二引物包含引物核苷酸序列。17.根据权利要求16所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对的引物还包含测序引物结合位点(SBS)。18.根据权利要求17所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对的第一引物包含引物核苷酸序列和引物核苷酸序列，并且所述至少一种第一捕获引物对的第二引物包含引物核苷酸序列和引物核苷酸序列。19.根据权利要求1至18所述的微阵列，其中所述第二层包含至少一种第二捕获引物对。20.根据权利要求19所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对。21.根据权利要求19或20所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端被封闭。22.根据权利要求21所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物是3’-磷酸封端的。23.根据权利要求22所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对的3’-磷酸封端的引物包含通用捕获区域。24.根据权利要求23所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对的第一引物包含引物核苷酸序列，并且所述至少一种第二捕获引物对的第二引物包含引物核苷酸序列。25.根据权利要求19或20所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端未被封闭。26.根据权利要求25所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域。27.根据权利要求26所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对的第一引物包含引物核苷酸序列，并且所述至少一种第二捕获引物对的第二引物包含引物核苷酸序列。28.根据权利要求14至28所述的微阵列，其中所述多种第一捕获引物对的多种捕获引物各自附接至靶多核苷酸。29.根据权利要求28所述的微阵列，其中所述多种靶多核苷酸在所述至少一个孔中形成靶多核苷酸的单克隆群体。30.根据权利要求29所述的微阵列，其中所述至少一个孔包含多个孔，并且其中所述多个孔的两个或更多个孔包含靶多核苷酸的单克隆群体。31.根据权利要求30所述的微阵列，其中所述多个孔的两个或更多个孔包含相同靶多核苷酸的单克隆群体。32.根据权利要求30所述的微阵列，其中所述多个孔的两个或更多个孔包含两种或更多种不同靶多核苷酸的单克隆群体。33.根据权利要求19至32所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对，并且所述至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对，并且其中所述多种第一捕获引物对和所述多种第二捕获引物对的多种引物附接至多种靶多核苷酸。34.根据权利要求33所述的微阵列，其中所述多种靶多核苷酸在所述至少一个孔中形成靶多核苷酸的单克隆群体。35.根据权利要求34所述的微阵列，其中所述至少一个孔是多个孔，并且其中所述多个孔的两个或更多个孔包含靶多核苷酸的单克隆群体。36.根据权利要求35所述的微阵列，其中所述多个孔的两个或更多个孔包含相同靶多核苷酸的单克隆群体。37.根据权利要求35所述的微阵列，其中所述多个孔的两个或更多个孔包含两种或更多种不同靶多核苷酸的单克隆群体。38.一种微阵列，所述微阵列包括：a)基底，所述基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面；以及b)层，所述层覆盖所述内部孔表面并包含至少一种第一捕获引物对和至少一种第二捕获引物对。39.根据权利要求38所述的微阵列，其中所述层不覆盖所述围绕所述孔的表面。40.根据权利要求38或39所述的微阵列，其中所述层至少部分地覆盖所述内部孔表面。41.根据权利要求38至40所述的微阵列，其中所述孔的直径为约1μm或更大。42.根据权利要求38至41所述的微阵列，其中所述至少一个孔是多个孔。43.根据权利要求42所述的微阵列，其中所述多个孔以约700nm的间距隔开。44.根据权利要求38至43所述的微阵列，其中所述第一层包含聚合物涂层。45.根据权利要求44所述的微阵列，其中所述聚合物涂层包含聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(PAZAM)。46.根据权利要求38至45所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对。47.根据权利要求38至46所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对。48.根据权利要求38至47所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。49.根据权利要求48所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对的第一捕获引物包含引物核苷酸序列，并且所述至少一种第一捕获引物对的第二捕获引物包含引物核苷酸序列。50.根据权利要求38至49所述的微阵列，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域和SBS。51.根据权利要求50所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对的第一捕获引物包含引物核苷酸序列，所述至少一种第一捕获引物对的第二捕获引物包含引物核苷酸序列，所述至少一种第二捕获引物对的第一捕获引物包含引物核苷酸序列和引物核苷酸序列，并且所述至少一种第二捕获引物对的第二捕获引物包含引物核苷酸序列和引物核苷酸序列。52.根据权利要求38至51所述的微阵列，其中所述至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对，并且所述至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对，并且其中所述多种第一捕获引物对和所述多种第二捕获引物对的多种引物附接至多种靶多核苷酸。53.根据权利要求52所述的微阵列，其中所述多种靶多核苷酸在所述至少一个孔中形成靶多核苷酸的单克隆群体。54.根据权利要求53所述的微阵列，其中所述至少一个孔是多个孔，并且其中所述多个孔的两个或更多个孔包含靶多核苷酸的单克隆群体。55.根据权利要求54所述的微阵列，其中所述多个孔的两个或更多个孔各自包含相同靶多核苷酸的单克隆群体。56.根据权利要求54所述的微阵列，其中所述多个孔的两个或更多个孔包含两种或更多种不同靶多核苷酸的单克隆群体。57.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中所述基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中所述第一层覆盖所述内部孔表面；b)在所述第一层中沉积至少一种第一捕获引物对；c)在所述基底上产生第二层，所述第二层覆盖所述第一层和所述围绕所述孔的表面；d)使包含多种靶多核苷酸的样品与所述基底在足以使靶多核苷酸与所述至少一种第一捕获引物对的捕获引物杂交的条件下接触，以及e)进行第一动力学排除测定(KEA)以从所述孔内的所述靶多核苷酸产生扩增子的克隆群体，从而扩增所述靶多核苷酸。58.根据权利要求57所述的方法，其中使包含所述多种靶多核苷酸的样品与所述基底在足以使每孔单个靶多核苷酸与所述至少一种第一捕获引物对的捕获引物杂交的条件下接触。59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述第一KEA从与所述至少一个孔中的捕获引物杂交的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。60.根据权利要求59所述的方法，其中所述至少一个孔是多个孔，并且其中从所述多个孔的两个或更多个孔中的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。61.根据权利要求60所述的方法，其中从所述多个孔的两个或更多个孔中的相同单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。62.根据权利要求60所述的方法，其中从所述多个孔的两个或更多个孔中的两种或更多种单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。63.根据权利要求57至62所述的方法，其中所述第一层不覆盖所述围绕所述孔的表面。64.根据权利要求57至63所述的方法，其中所述第一层至少部分地覆盖所述内部孔表面。65.根据权利要求57至64所述的方法，其中所述孔的直径小于约1μm。66.根据权利要求57至65所述的方法，其中所述至少一个孔是多个孔。67.根据权利要求57至66所述的方法，其中所述第一层包含聚合物涂层。68.根据权利要求67所述的方法，其中所述聚合物涂层包含聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(PAZAM)。69.根据权利要求57至68所述的方法，其中所述第二层包含聚合物涂层。70.根据权利要求69所述的方法，其中所述聚合物涂层包含PAZAM或SFA。71.根据权利要求57至70所述的方法，其中所述至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对。72.根据权利要求57至71所述的方法，所述方法还包括在所述第二层中沉积至少一种第二捕获引物对。73.根据权利要求72所述的方法，其中所述至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对。74.根据权利要求72或73所述的方法，其中在进行所述第一KEA之前沉积所述至少一种第二捕获引物对。75.根据权利要求57至74所述的方法，其中所述至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。76.根据权利要求75所述的方法，其中所述至少一种第一捕获引物对的第一捕获引物包含引物核苷酸序列，并且所述至少一种第一捕获引物对的第二捕获引物包含引物核苷酸序列。77.根据权利要求57至76所述的方法，其中所述多种靶多核苷酸侧翼为一个或更多个互补通用捕获区域。78.根据权利要求72至77所述的方法，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端被封闭。79.根据权利要求78所述的方法，其中所述3’-封闭的引物包含通用捕获区域。80.根据权利要求79所述的方法，其中所述通用捕获区域包含引物核苷酸序列或引物核苷酸序列。81.根据权利要求78至80所述的方法，所述方法还包括在进行所述第一KEA之后使所述至少一种第二捕获引物对的引物去封闭。82.根据权利要求81所述的方法，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物使用T4-激酶去封闭。83.根据权利要求57至82所述的方法，所述方法还包括进行桥式扩增或第二KEA以扩大靶多核苷酸扩增子的克隆群体。84.根据权利要求83所述的方法，其中所述第一捕获引物对的引物还包含SBS。85.根据权利要求84所述的方法，其中所述至少一种第一引物对的第一引物包含引物核苷酸序列和引物核苷酸序列，并且所述至少一种第一引物对的第二引物包含引物核苷酸序列和引物核苷酸序列。86.根据权利要求85所述的方法，其中所述多种靶多核苷酸侧翼为一个或更多个互补SBS。87.根据权利要求72至77所述的方法，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端是未封闭的。88.根据权利要求87所述的方法，其中所述至少一种第二引物对的引物包含通用捕获区域。89.根据权利要求88所述的方法，其中所述通用捕获区域包含引物核苷酸序列或引物核苷酸序列。90.根据权利要求89所述的方法，其中所述第一KEA进行延长的时间段以扩大扩增子的克隆群体超出所述至少一个孔。91.根据权利要求72或73所述的方法，其中在进行所述第一KEA之后沉积所述至少一种第二捕获引物对。92.根据权利要求91所述的方法，其中所述至少一种第一捕获引物对和所述至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域。93.根据权利要求92所述的方法，其中所述通用捕获区域包含引物核苷酸序列或引物核苷酸序列。94.根据权利要求93所述的方法，所述方法还包括进行桥式扩增或第二KEA以扩大靶多核苷酸扩增子的克隆群体超出所述至少一个孔。95.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中所述基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中所述第一层至少部分地覆盖所述内部孔表面；b)在所述第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中所述第一捕获引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分，所述多种第二捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分；c)在所述基底上产生第二层，所述第二层覆盖所述第一层和所述围绕所述孔的表面；d)在所述第二层中沉积至少一种第二捕获引物对，其中所述第二捕获引物对为3’磷酸封端的，并且包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分，所述多种第二捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分；e)使包含多种靶多核苷酸的样品与所述基底在足以使每孔单个靶多核苷酸与所述至少一种第一捕获引物对的引物杂交的条件下接触，其中所述靶多核苷酸侧翼为各自包含互补的引物核苷酸序列或互补的引物核苷酸序列的互补通用引物区域；f)进行第一KEA以从所述至少一个孔内的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体，由此扩增所述靶多核苷酸；g)使所述基底与T4-激酶接触以使所述第二引物对的引物去封闭，以及h)进行桥式扩增或第二KEA以扩大所述单个靶多核苷酸扩增子的单克隆群体超出所述孔。96.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中所述基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中所述第一层至少部分地覆盖所述内部孔表面；b)在所述第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中所述第一捕获引物对包括多个至少一种第一捕获引物和多个至少一种第二捕获引物，所述多个至少一种第一捕获引物包含含引物核苷酸序列和引物核苷酸序列的3’部分，所述多个至少一种第二捕获引物包含含引物核苷酸序列和引物核苷酸序列的3’部分；c)在所述基底上产生第二层，所述第二层覆盖所述第一层和所述围绕所述孔的表面；d)在所述第二层中沉积至少一种第二捕获引物对，其中所述至少一种第二捕获引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分，所述多种第二捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分；e)使包含多种靶多核苷酸的样品与所述基底在足以使每孔单个靶多核苷酸与所述至少一种第一捕获引物对的引物杂交的条件下接触，其中所述多种靶多核苷酸侧翼为各自包含互补的引物核苷酸序列或互补的核苷酸序列的互补的SBS，以及f)进行KEA延长的时间以从所述至少一个孔内部和外部的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体，从而扩增所述孔内的单个靶多核苷酸，并扩大靶多核苷酸的单克隆群体超出所述至少一个孔。97.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中所述基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中所述第一层至少部分地覆盖所述内部孔表面；b)在所述第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中所述第一引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分，所述多种第二捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分；c)在所述基底上产生第二层，所述第二层覆盖所述第一层和所述围绕所述孔的表面；d)使包含多种靶多核苷酸的样品与所述基底在足以使每孔单个靶多核苷酸与所述至少一种第一捕获引物对的引物杂交的条件下接触，其中所述多种多核苷酸侧翼为各自包含互补的引物核苷酸序列或互补的引物核苷酸序列的互补通用引物区域；e)进行第一KEA以从所述至少一个孔内的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体，由此扩增所述靶多核苷酸；f)在所述第二层中沉积至少一种第二捕获引物对，其中所述至少一种第二捕获引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分，所述多种第二捕获引物包含含引物核苷酸序列的3’部分，以及g)进行桥式扩增或第二KEA以扩大所述单个靶多核苷酸的扩增子的单克隆群体。98.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生层，其中所述基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中所述孔具有约1μm或更大的直径，并且其中所述层至少部分地覆盖所述内部孔表面；b)在所述层中沉积至少一种第一捕获引物对和至少一种第二捕获引物对，其中所述至少一种第一捕获引物对的引物密度高于所述至少第二引物对的引物密度；c)使包含多种靶多核苷酸的样品与所述基底在足以使每孔单个靶多核苷酸与所述第二引物杂交的条件下接触，以及d)进行KEA以从与所述孔内的所述第二引物杂交的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体，从而扩增所述单个靶多核苷酸。99.根据权利要求98所述的方法，其中所述多种靶多核苷酸侧翼为各自包含互补的引物核苷酸序列或互补的引物核苷酸序列的互补的SBS。100.根据权利要求98所述的方法，其中所述至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。101.根据权利要求100所述的方法，其中所述至少一种第一捕获引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含引物核苷酸序列，所述多种第二捕获引物包含引物核苷酸序列。102.根据权利要求98至101所述的方法，其中所述至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域和SBS。103.根据权利要求102所述的方法，其中所述至少一种第二捕获引物对包括多种第一捕获引物和第二多种捕获引物，所述多种第一捕获引物包含引物核苷酸序列或其片段和引物核苷酸序列或其片段，所述第二多种捕获引物包含引物核苷酸序列或其片段和引物核苷酸序列或其片段。104.一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使包含多种固定的捕获引物的基底与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中所述多种固定的捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含5’-末端通用捕获区域Y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域Z，以及其中每一种模板核酸侧翼为5’-末端和3’-末端通用捕获区域Y或Z，并且包含一个或更多个限制性位点和在5’-末端通用捕获区域和所述一个或更多个限制性位点之间或在3’-末端通用捕获区域和一个或更多个限制性位点之间的靶特异性捕获区域，以及b)延伸一种或更多种固定的捕获引物以产生与所述一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物。105.根据权利要求104所述的方法，其中所述通用捕获区域Y包含引物核苷酸序列，且所述通用捕获区域Z包含引物核苷酸序列。106.根据权利要求105所述的方法，其中每一种模板核酸的5’-末端通用捕获区域包含互补的引物核苷酸序列，并且每一种模板核酸的3’-末端通用捕获区域包含互补的引物核苷酸序列。107.根据权利要求106所述的方法，其中每一种模板核酸的5’-末端通用捕获区域包含互补的引物核苷酸序列，并且每一种模板核酸的3’-末端通用捕获区域包含互补的引物核苷酸序列。108.根据权利要求107所述的方法，其中每一种模板核酸的靶特异性捕获区域位于所述3’-末端通用捕获区域和所述一个或更多个限制性位点之间。109.根据权利要求104所述的方法，其中每一种模板核酸的靶特异性捕获区域位于所述5’-末端通用捕获区域和所述一个或更多个限制性位点之间。110.根据权利要求104所述的方法，其中每一种模板核酸包含两个限制性位点和在所述两个限制性位点之间的间隔区域。111.根据权利要求110所述的方法，其中所述两个限制性位点是SapI位点。112.根据权利要求110或111所述的方法，其中所述间隔区域包含约150个碱基。113.根据权利要求104至112所述的方法，其中所述基底是包括多个垫的图案化流通池。114.根据权利要求113所述的方法，其中每一个垫包括第一多种固定的通用捕获引物和第二多种固定的通用捕获引物，所述第一多种固定的通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域Y，所述第二多种固定的通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域Z。115.根据权利要求114所述的方法，其中所述多个垫的每个垫产生单个固定的延伸产物。116.根据权利要求115所述的方法，其中每个垫产生的所述单个固定的延伸产物与所述多个垫的所有垫中的相同模板核酸互补。117.根据权利要求116所述的方法，其中每个垫产生的所述单个固定的延伸产物与所述多个垫的两个或更多个垫中的两种或更多种不同的模板核酸互补。118.根据权利要求117所述的方法，其中每个垫产生的所述单个固定的延伸产物与所述多个垫的至少1％、至少3％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的垫的每一个垫中的不同模板核酸互补。119.根据权利要求118所述的方法，其中单个固定的延伸产物在多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的垫中产生。120.根据权利要求118所述的方法，其中单个固定的延伸产物在小于100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的垫中产生。121.根据权利要求104至120所述的方法，所述方法还包括通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的双链模板核酸的一种或更多种单克隆簇。122.根据权利要求121所述的方法，其中通过PCR扩增包括桥式扩增或KEA。123.根据权利要求122所述的方法，所述方法还包括使固定的双链模板核酸的一种或更多种单克隆簇与限制性酶接触以切割多种固定的双链模板核酸中的所述一个或更多个限制性位点以产生多种固定的双链嵌合捕获引物和多种双链固定的再生的通用捕获引物，所述多种固定的双链嵌合捕获引物包含通用捕获区域和靶特异性捕获区域。124.根据权利要求123所述的方法，其中所述限制性酶为SapI。125.根据权利要求124所述的方法，所述方法还包括热变性所述多种固定的双链嵌合捕获引物和双链固定的再生的通用捕获引物以产生多种单链固定的嵌合捕获引物和单链固定的再生的通用捕获引物。126.根据权利要求125所述的方法，所述方法还包括使所述多种固定的双链嵌合捕获引物和双链固定的再生的通用捕获引物与5’-3’双链脱氧核糖核酸(dsDNA)外切核酸酶接触以产生多种单链固定的嵌合捕获引物和单链固定的再生的通用捕获引物。127.根据权利要求126所述的方法，其中所述基底是包括多个垫的图案化流通池。128.根据权利要求127所述的方法，其中每一个垫包括第一多种捕获引物和第二多种通用捕获引物，所述第一多种捕获引物包含3’-末端通用捕获区域Y，所述第二多种通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域Z。129.根据权利要求128所述的方法，其中在所述多个垫的一个或更多个垫中，多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含所述3’-末端通用捕获区域Y的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物。130.根据权利要求128所述的方法，其中在所述多个垫的一个或更多个垫中，多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含3’-末端通用捕获区域Z的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物。131.根据权利要求128所述的方法，其中在所述多个垫中的一个或更多个...
【专利技术属性】
技术研发人员：凯文·L·冈德森，白经纬，马修·威廉·克林格，约翰·M·拜尔勒，乔纳森·马克·鲍特尔，罗伯托·里加蒂，玛丽亚·坎德拉里亚·罗杰特巴奇伽鲁普，博扬·波亚诺夫，克劳斯·梅辛格，
申请(专利权)人：伊鲁米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。