低分子量肽或蛋白质的纳米沉淀物的制备方法技术

本发明专利技术涉及肽或蛋白质纳米沉淀物或肽或蛋白质和金属离子纳米共沉淀物的非变性制备方法，其中所述蛋白质或所述肽的分子量不高于20kDa，优选地不高于15kDa，有利地不高于10kDa，更有利地不高于8kDa。所述方法包括制备肽或蛋白质的水溶液、肽或蛋白质的非溶剂以及任选地水溶性金属盐的混合物的步骤。本发明专利技术还涉及可通过根据本发明专利技术的方法获得的纳米沉淀物，以及包括该纳米沉淀物的药物组合物，用于治疗和预防糖尿病。

Process for preparing nano precipitate of low molecular weight peptide or protein

The invention relates to a preparation method of non denatured peptide or protein or peptide or protein nano precipitates and metal ion nano coprecipitate, wherein the molecular protein or the peptides were less than 20kDa, preferably not more than 15kDa, advantageously not higher than 10kDa, better not higher than 8kDa. The method comprises the steps of preparing an aqueous solution of a peptide or protein, a non solvent of a peptide or protein, and optionally a mixture of water-soluble metal salts. The invention also relates to nano precipitates that can be obtained by means of the methods according to the invention, and pharmaceutical compositions comprising the nanoparticles for the treatment and prevention of diabetes.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】低分子量肽或蛋白质的纳米沉淀物的制备方法
本专利技术涉及肽或蛋白质纳米沉淀物或肽或蛋白质和金属离子(优选二价金属离子)纳米共沉淀物的非变性制备方法，其中肽或蛋白质具有低分子量，并且涉及可通过这种方法获得的纳米沉淀物或纳米共沉淀物。本专利技术还涉及一种药物组合物，特别是控释药物组合物，其包含所述纳米沉淀物或纳米共沉淀物，并且涉及所述药物组合物在人和动物健康领域中的用途。
技术介绍
肽和蛋白质是复杂的，高度有机化的结构，对它们的环境高度敏感，并且可容易地变性。肽或蛋白质的变性通常导致活性的确定性或暂时性丧失。然而，迄今已知的用于沉淀肽或蛋白质的方法是引起变性的，因为它们包括对肽/蛋白质的结构潜在有害的条件，因此使它们失去活性，诸如高温，快速搅拌或与疏水性表面、水性/有机界面或洗涤剂接触的条件。肽或蛋白质，特别是治疗性肽或蛋白质的纳米沉淀使得能够例如改善它们在受体生物体中的释放特征及它们的生物利用度。它还能实现浓缩的肽/蛋白质悬浮液的冻干和高度富集肽或蛋白质同时具有低的或没有粘度的药物组合物的制备，所述药物组合物包括在不存在变性聚集的情况下获得的纳米沉淀物。在文献中存在蛋白质纳米沉淀的方法，例如蛋白质去溶剂化技术，其产生尺寸通常大于一微米的蛋白质沉淀物。然而，这些方法通常导致蛋白质的变性，或不可能在没有所必需的除了非溶剂之外的聚合物的情况下获得蛋白质沉淀物。例如，专利申请WO2009/043874公开了一种制备平均直径为50至200nm的泊洛沙姆-蛋白纳米颗粒的方法，其中蛋白质的分子量优选高于8kDa，并且不变性。所述纳米颗粒是泊洛沙姆-蛋白复合物；因此除了非溶剂之外的另外的聚合物是获得它们所必需的。因此，亟需开发用于低分子量肽或蛋白质的非变性纳米沉淀的技术，所述低分子量肽或蛋白质不与促进它沉淀或与金属离子(优选二价金属离子)共沉淀的另一分子复合。肽或蛋白质优选是治疗性肽或蛋白质，例如胰岛素。
技术实现思路
在本专利技术的上下文中，本专利技术人发现了一种分子量为20kDa或更低，优选15kDa或更低，有利地为10kDa或更低，更有利地为8kDa或更低的肽或蛋白质的纳米沉淀物的非变性制备的新方法，使得能够获得非变性肽或蛋白质的纳米沉淀物，或所述非变性肽或蛋白质和金属离子(优选二价金属离子)的纳米共沉淀物，可将其掺入药物组合物中，优选控释药物组合物中。本专利技术能够在温和、非变性条件下获得低分子量肽或蛋白质的纳米沉淀物或低分子量肽或蛋白质和金属离子的纳米共沉淀物。它包括接触低分子量肽或蛋白质的溶液，肽或蛋白质的有机非溶剂，例如选自低分子量聚乙二醇或聚乙二醇衍生物的有机二醇，特别是PEG550，以及选自己二醇、丁烷-1,4-二醇、戊烷-1,5-二醇、乙基己二醇、2-甲基戊烷-2,4-二醇(己二醇)、3-环戊烯-1,2-二醇、顺-4-环戊烯-1,3-二醇、反-1,4-二噁烷-2,3-二醇、1,3-二噁烷-5,5-二甲醇、(3S,4S)-吡咯烷-3,4-二醇、(3R,4R)-(-)-1-苄基-3,4-吡咯烷二醇、(3S,4S)-(+)-1-苄基-3,4-吡咯烷二醇、3-环戊烯-1,2-二醇、2-甲基-丁烷-1,3-二醇的有机二醇。根据本专利技术的纳米沉淀方法能够获得可用作用于单次肠胃外施用的药用产品的肽或蛋白质纳米沉淀物或纳米共沉淀物，使得所述肽或蛋白质的血浆浓度在治疗窗内的持续时间大于未按照本专利技术的制备方法进行制备的相同肽或蛋白质在单次胃肠外施用之后的血浆浓度在治疗窗内的持续时间。因此，根据本专利技术的纳米沉淀能够控制肽或蛋白质的释放速率，特别是为了获得生物活性形式的肽或蛋白质的缓释持续至少2天，优选2天至几个月。根据本专利技术的纳米沉淀还能够制备高度富集所述肽或蛋白质同时具有低粘度的药物组合物。药物组合物的低粘度，特别可用于其肠胃外施用，特别是其非静脉内肠胃外施用。在第一方面中，本专利技术涉及平均直径小于1μm的肽或蛋白质纳米沉淀物或肽或蛋白质和金属离子纳米共沉淀物的非变性制备方法，其包括以下步骤：a)制备肽或蛋白质的水溶液、肽或蛋白质的非溶剂以及任选的水溶性金属盐的混合物；b)温和搅拌在步骤a)中获得的混合物；c)固液分离在步骤b)中获得的混合物；和d)任选地，收集肽或蛋白质纳米沉淀物或肽或蛋白质和金属离子纳米共淀物，其中所述肽或蛋白质的分子量为20kDa或更低，优选为15kDa或更低，有利地为10kDa或更低，更有利地为8kDa或更低，并且所述非溶剂选自分子量小于2000Da，有利地为200至2000Da，更有利地为550Da的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物，以及选自己二醇、丁烷-1,4-二醇、戊烷-1,5-二醇，乙基己二醇、2-甲基戊烷-2,4-二醇(己二醇)、3-环戊烯-1,2-二醇、顺-4-环戊烯-1,3-二醇、反-1,4-二噁烷-2,3-二醇、1,3-二噁烷-5,5-二甲醇、(3S,4S)-吡咯烷-3,4-二醇、(3R,4R)-(-)-1-苄基-3,4-吡咯烷二醇、(3S,4S)-(+)-1-苄基-3,4-吡咯烷二醇、3-环戊烯-1,2-二醇、2-甲基-丁烷-1,3-二醇的有机二醇。在本专利技术的上下文中，“非变性制备方法”意思是不会使所述肽或蛋白质变性的肽或蛋白质的纳米沉淀或纳米共沉淀的方法。因此，根据本专利技术的纳米沉淀或纳米共沉淀的方法能够获得保留它们的正常三维构象以及它们的完整性及它们的生物活性的肽或蛋白质。优选地，根据本专利技术的方法能够获得其中85％，特别是90％，更特别是100％的蛋白质或肽不变性的肽或蛋白质纳米沉淀物或纳米共沉淀物。更优选地，根据本专利技术的方法能够获得其中100％的蛋白质或肽不变性的蛋白质或肽纳米沉淀物或纳米共沉淀物。在本专利技术的上下文中，“肽或蛋白质纳米沉淀物”意指平均直径小于1μm，有利地为5nm至500nm，更有利地为5nm至200nm，甚至更有利地为5nm至170nm，特别地为5nm至150nm的颗粒，这是一种或多种肽和/或一种或多种蛋白质在非溶剂中沉淀的结果。根据本专利技术的肽或蛋白质纳米沉淀物基本上由(多种)肽或(多种)蛋白质组成。根据有利的实施方案，根据本专利技术的肽或蛋白质纳米沉淀物由大于90％，特别地大于95％，更特别地大于99％的(多种)肽或(多种)蛋白质组成，其余为杂质，例如所使用的非溶剂的杂质。有利地，本专利技术涉及一种低分子量肽或蛋白质的纳米沉淀物或低分子量肽或蛋白质和金属离子的纳米共沉淀物的非变性制备方法，平均直径为小于1μm，有利地为5nm至500nm，更有利地为5nm至200nm，甚至更有利地为5nm至170nm，特别地为5nm至150nm。根据另一方面，本专利技术涉及肽或蛋白质和金属离子纳米共沉淀物的非变性制备方法，其中所述肽或蛋白质的分子量为20kDa或更低，优选15kDa或更低，有利地为10kDa或更低，更有利地为8kDa或更低，并且所述金属离子选自锌(Zn)、锰(Mn)、镁(Mg)、钙(Ca)、铁(Fe)、锂(Li)和铜(Cu)。优选地，所述金属离子是选自锌(Zn)、锰(Mn)、镁(Mg)、钙(Ca)、铁(Fe)和铜(Cu)，优选锌(Zn)或锰(Mn)的二价金属离子。“一价金属离子”意指具有一价的离子，因此可以与另一个离子或分子形成键。例如，一价金属阴离子是相对于它的元素态具有一个附加电子的离本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有小于1μm的平均直径的肽或蛋白质纳米沉淀物或肽或蛋白质和金属离子纳米共沉淀物的非变性制备方法，其包括以下步骤：a)制备肽或蛋白质的水溶液、肽或蛋白质的非溶剂以及任选地水溶性金属盐的混合物；b)温和搅拌在步骤a)中获得的混合物；c)固液分离在步骤b)中获得的混合物；和d)任选地，收集肽或蛋白质纳米沉淀物或肽或蛋白质和金属离子纳米共淀物，其中所述肽或蛋白质的分子量为20kDa或更低，优选地15kDa或更低，有利地10kDa或更低，更有利地8kDa或更低，并且所述非溶剂选自分子量小于2,000Da，有利地为200至2,000Da，更有利地为550Da的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物，以及选自己二醇、丁烷‑1,4‑二醇、戊烷‑1,5‑二醇，乙基己二醇、2‑甲基戊烷‑2,4‑二醇(己二醇)、3‑环戊烯‑1,2‑二醇、顺‑4‑环戊烯‑1,3‑二醇、反‑1,4‑二噁烷‑2,3‑二醇、1,3‑二噁烷‑5,5‑二甲醇、(3S,4S)‑吡咯烷‑3,4‑二醇、(3R,4R)‑(‑)‑1‑苄基‑3,4‑吡咯烷二醇、(3S,4S)‑(+)‑1‑苄基‑3,4‑吡咯烷二醇、3‑环戊烯‑1,2‑二醇、2‑甲基‑丁烷‑1,3‑二醇的有机二醇。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.26 EP 14306318.81.具有小于1μm的平均直径的肽或蛋白质纳米沉淀物或肽或蛋白质和金属离子纳米共沉淀物的非变性制备方法，其包括以下步骤：a)制备肽或蛋白质的水溶液、肽或蛋白质的非溶剂以及任选地水溶性金属盐的混合物；b)温和搅拌在步骤a)中获得的混合物；c)固液分离在步骤b)中获得的混合物；和d)任选地，收集肽或蛋白质纳米沉淀物或肽或蛋白质和金属离子纳米共淀物，其中所述肽或蛋白质的分子量为20kDa或更低，优选地15kDa或更低，有利地10kDa或更低，更有利地8kDa或更低，并且所述非溶剂选自分子量小于2,000Da，有利地为200至2,000Da，更有利地为550Da的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物，以及选自己二醇、丁烷-1,4-二醇、戊烷-1,5-二醇，乙基己二醇、2-甲基戊烷-2,4-二醇(己二醇)、3-环戊烯-1,2-二醇、顺-4-环戊烯-1,3-二醇、反-1,4-二噁烷-2,3-二醇、1,3-二噁烷-5,5-二甲醇、(3S,4S)-吡咯烷-3,4-二醇、(3R,4R)-(-)-1-苄基-3,4-吡咯烷二醇、(3S,4S)-(+)-1-苄基-3,4-吡咯烷二醇、3-环戊烯-1,2-二醇、2-甲基-丁烷-1,3-二醇的有机二醇。2.如权利要求1所述的方法，特征在于，所述纳米沉淀物或纳米共沉淀物的平均直径为5nm至500nm，特别为5nm至200nm，更特别地为5nm至170nm。3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，特征在于，所述金属离子选自Zn、Mg、Ca、Mn、Fe、Li或Cu离子，有利地所述金属离子是Zn或Mn。4.如前述权利要求中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥利维尔·迈尔，托马斯·皮埃尔，莫德·戈内，
申请(专利权)人：卡利娜科技公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR