含有减毒睡眠嗜组织菌的免疫组合物制造技术

本公开提供了减毒睡眠嗜组织菌株、包含其的组合物以及其产生和使用的方法。减毒株相对于对应的致病菌可表达较低水平或无水平的各种毒力相关基因。有利地，可口服、鼻内、气管内或皮下施用减毒睡眠嗜组织菌株。

Immune composition containing attenuated sleeping tissue bacteria

The present disclosure provides attenuated sleeping tissue strains, compositions comprising them, and methods for their production and use. Compared with the corresponding pathogens, attenuated strains can express low levels or no levels of virulence related genes. Advantageously, attenuated sleeping tissue strains can be administered orally, nasal, endotracheal, or subcutaneously.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含有减毒睡眠嗜组织菌的免疫组合物通过引用并入本申请要求2014年3月25日提交的美国临时申请USSN61/970,195的优先权，并且所述临时申请通过引用整体并入本文。本文中引用的所有其它参考文献也通过引用整体并入本文。关于序列表的申明以文本格式替代纸质拷贝提供与本申请相关的序列表，并且将所述序列表在此通过引用并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称为MER_13_225P_ST25。该文本文件为17,356KB；其创建于2014年2月20日；并在提交本说明书的同时将其通过EFS-Web电子提交。专利
本专利技术总的来说涉及经遗传工程化的减毒细菌疫苗，特别地为牛类提供免受由睡眠嗜组织菌(Histophilussomni)(以前称为睡眠嗜血杆菌(Haemophilussomnus))引起的感染/疾病的广泛、安全和有效的保护的那些疫苗。本专利技术还涉及产生该减毒细菌的方法，以及与该减毒细菌的减弱的致病性相关的核酸变异的鉴定。本专利技术因而涉及包含本专利技术的细菌(例如活的减毒细菌)的免疫原性或疫苗组合物。也可在组合物中灭活细菌；但可有利的是，所述细菌是活的减毒睡眠嗜组织菌。本专利技术因此还涉及用于制备和/或配制此类组合物的方法；例如，在合适的培养基上或中培养或生长或繁殖所述细菌，收获所述细菌，任选灭活所述细菌，以及任选将其与合适的兽医学上或药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或媒介物和/或佐剂和/或稳定剂混合。因此，本专利技术还涉及细菌在配制此类组合物中的用途。专利技术背景牛呼吸道疾病综合征(BRDC)由多种微生物病原体组成，并对养牛业造成重大经济损失。据估计治疗成本(包括预防接种疫苗和暴发后药物治疗)将近每年40亿美元(Griffin,1997)。造成经济影响的还有在诊断为BRDC的动物中所观察到的性能相关损失；平均日增重、收获时的体重以及牛肉质量等级的可测量的损失(Babcock,2010)。关于与性能降低相关的具体货币损失的报道不一；可能是由于对BRDC的不同情况下的定义，但据估计在每只动物$40(Fulton,2002)与几乎$300(Duff和Gaylean2011)之间。还已显示性能损失随动物需要BRDC治疗的次数增加而显著增加(Fulton,2002)。睡眠嗜组织菌(以前称为睡眠嗜血杆菌)已被鉴定为BRDC的关键影响因素(Duff和Gaylean2011)。属于巴氏杆菌(Pasterellacea)科的该革兰阴性多形球杆菌(pleomorphiccoccobacillus)(Korczak,2004)构成牛、羊和其它反刍动物中的上呼吸道和泌尿生殖道的正常菌群的一部分(Ward,2006)。它与其它牛病原体包括多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)和溶血曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)(这两者也与BRDC相关联)，以及人病原体杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)密切相关(Challacombe,2007)。从健康小牛的上呼吸道睡眠嗜组织菌的分离率估计高达无疾病临床表现的50％；然而诊断为BRDC的动物对于所述细菌具有甚至更高的分离率(Griffin,2010)。在应激条件或免疫抑制状态下，睡眠嗜组织菌可定殖在下呼吸道、心内膜或中枢神经系统，并且已被鉴定为多种疾病，诸如肺炎、心内膜炎、关节炎、流产、败血症和血栓栓塞性脑膜脑炎(TEME)的病原体(Ward,2006)。在屠宰时，少于15％的接受针对BRDC的适当治疗(预防接种疫苗和在爆发期间的适当抗生素)的动物显示肺部病变的体征，并且这些病变牵涉不到总肺的5％(Griffin,2010)。相反，50％的未接受适当护理的动物在屠宰时显示肺部病变，并且这些病变可牵涉总肺的15％或更多(Griffin,2010)。在超过10,000只动物的一个现场研究中，459头小牛(4.6％)死于一种或另一种形式的疾病。在该研究的死亡中，279头(60.8％)经显示与呼吸系统疾病相关，并且在那些患有呼吸道感染的动物中，226头(81.0％)与睡眠嗜组织菌相关肺炎、胸膜炎或脓肿相关(Ribble,1988)。虽然抗生素治疗可成功地响应于睡眠嗜组织菌感染，但日益增加的抗生素抗性现场分离株的流行令人关注(Duff和Gaylean,2011)。通过接种疫苗进行的预防护理将是优选的，因为其是积极主动的而非被动的，并且更具成本效益。目前可从不同动物保健公司获得许多睡眠嗜组织菌疫苗；然而，这些疫苗主要由死菌苗组成，而且是在超过三十年前获得许可的，目的在于预防TEME。这些菌苗疫苗的使用已经有效对抗TEME，然而已显示其对育肥牛(feedlotcattle)的呼吸道疾病具有中性或甚至消极作用。消极副作用包括当对感染了牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的小牛接种疫苗时IgE诱导的过敏性休克和相互作用(Griffin,2010)。TEME的流行性的减少以及始于80年代末的睡眠嗜组织菌相关肺炎(在美国)和心肌炎(在加拿大)的出现，已经导致对用于疫苗生产的有效抗原的进一步研究的需要(O'Toole,2009)。睡眠嗜组织菌相关肺炎对于牛肉和乳制品行业是经济上重大的病况。在目前可用的疫苗中很少存在现场药效的证据，因此对于得到下一代疫苗产品的研究的需要是完全正当合理的。专利技术概述本专利技术的目的是提供用于治疗和预防由睡眠嗜组织菌引起的感染的减毒细菌以及方法。在实施方案中，疫苗包含减毒睡眠嗜组织菌，其相较于更具毒力的株致病性较弱。全面的比较序列分析显示相对于毒力更强的株，在减毒睡眠嗜组织菌株中不存在重要的毒力因子。因此，本专利技术的目的是提供减毒睡眠嗜组织菌，其缺乏由毒力更强的睡眠嗜组织菌株所具有的毒力因子。如本文所定义的，术语“基因”将在广泛的意义上使用，并应包括编码和非编码序列(即上游和下游调控序列、启动子、5'/3'UTR、内含子和外显子)。当旨在只提及基因的编码序列时，术语“基因的编码序列”或“CDS”在本专利技术的整个说明书中可互换使用。当论述特定的核酸时，本领域技术人员将即刻拥有该序列的所有可衍生的形式(mRNA、vRNA、cRNA、DNA、蛋白质等)。本专利技术还提供用于诱导抗睡眠嗜组织菌的免疫(或免疫原性)或保护性应答的方法，以及用于预防或治疗睡眠嗜组织菌，或由睡眠嗜组织菌引起的疾病状态的方法，包括向有此需要的动物施用所述减毒睡眠嗜组织菌，或包含该减毒睡眠嗜组织菌的组合物。此外，还提供了包含至少减毒睡眠嗜组织菌株和使用说明书的试剂盒。这些和其它实施方案已被公开的，或根据以下详述是显而易见的，并且被以下详述所涵盖。附图简述本专利技术的完整且可行的公开内容，包括本领域普通技术人员知晓的其最佳模式，更具体地示于本说明书的其余部分，包括参考附图，其中：图1显示在攻击模型中测试的每一株分离株和剂量的平均肺部病变百分比。根据对反正弦变换数据进行的学生氏t检验，具有不同字母的组是显著不同的；图2显示其中鼻内施用疫苗的接种攻击研究中对于每一小牛观察到的肺部病变百分比。相同颜色的条块代表利用同一分离株接种的动物的结果。接种分离株列于条块下方，利用同一攻击分离株攻击所有动物。根据对反正弦变换数据进行的学生氏t检验，后跟相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种减毒睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)株，其能够在牛类动物中提供抗睡眠嗜组织菌或由睡眠嗜组织菌引起的疾病的安全有效的免疫应答；其中所述减毒株相对于参照强毒睡眠嗜组织菌株在其基因组序列中缺少最小数量的毒力因子编码基因；并且其中该毒力因子编码基因的相对不足使得所述减毒株不能在所述牛类动物中引起感染。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.25 US 61/970,1951.一种减毒睡眠嗜组织菌(Histophilussomni)株，其能够在牛类动物中提供抗睡眠嗜组织菌或由睡眠嗜组织菌引起的疾病的安全有效的免疫应答；其中所述减毒株相对于参照强毒睡眠嗜组织菌株在其基因组序列中缺少最小数量的毒力因子编码基因；并且其中该毒力因子编码基因的相对不足使得所述减毒株不能在所述牛类动物中引起感染。2.权利要求1的减毒株，其中所述参照强毒株包含基因组DNA序列，其编码和表达至少99％或100％的与如SEQIDNO:2中所示的序列所编码的基因相同的基因；和其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQIDNO:1、3、4和5中之任一所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。3.权利要求2的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少100％的与如SEQIDNO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因。4.权利要求2的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少99％的与如SEQIDNO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因；和其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQIDNO:1中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。5.权利要求1的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少99％的与如SEQIDNO:3中所示的序列所编码的基因相同的基因；和其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQIDNO:3中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。6.权利要求1的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少99％的与如SEQIDNO:4中所示的序列所编码的基因相同的基因；和其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQIDNO:4中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。7.权利要求1的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少99％的与如SEQIDNO:5中所示的序列所编码的基因相同的基因；和其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQIDNO:5中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。8.权利要求1的减毒株，其中所述减毒株相对于睡眠嗜组织菌株2336缺少至少99％的与睡眠嗜组织菌株#4所编码的基因相同的基因；其中菌株2336包含基因组序列，其编码和表达至少99％的与如SEQIDNO:6中所示的序列所编码的基因相同的基因；和其中菌株#4包含基因组序列，其编码和表达至少99％的与如SEQIDNO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因。9.权利要求1的减毒株，其编码和表达至少99％的与在名称PTA-121029(TK#4)或PTA-121030(TK#42)下保藏在ATCC中的菌株中的基因相同的基因。10.权利要求9的菌株，其中所述菌株是与在名称PTA-121029(TK#4)下保藏在ATCC中的菌株相同的菌株。11.权利要求9的菌株，其中所述菌株是与在名称PTA-121030(TK#42)下保藏在ATCC中的菌株相同的菌株。12.一种免疫组合物，其包含权利要求1至11的任一项的减毒株或基本上由其组成。13.权利要求12的组...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·柯兰德，P·劳伦斯，R·拜，
申请(专利权)人：梅里亚股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US