母乳低聚糖快速定性定量的方法技术

本发明专利技术公开了一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，主要包括以下步骤：步骤1、样品前处理：取150‑250μl母乳，去除脂肪和蛋白质，得最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品；步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线；步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合标准曲线，进行定量分析，即得母乳低聚糖含量。所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以8‑10mmol/L的甲酸铵溶液(A)和乙腈(B)为流动相；梯度洗脱程序为：0‑10min，95％‑75％B；10‑15min，75％B；15‑20min，75％‑65％B；20‑21min，65％‑10％B；21‑24min，10％B；24‑25min，10‑95％B；25‑35min，95％B；流速为0.3mL/min，柱温40‑60℃。本发明专利技术可快速检测12种母乳低聚糖，并可对12种母乳低聚糖定量。

【技术实现步骤摘要】
母乳低聚糖快速定性定量的方法
本专利技术涉及母乳低聚糖的检测领域，尤其涉及一种母乳低聚糖快速定性定量的方法。
技术介绍
母乳低聚糖具有多种生理功能，不仅可以减少感染的发生，还可有效促进肠道有益菌群的增殖，间接抑制有害菌群生长，以维持肠道微生态平衡，从而保护婴儿肠道免受致病菌侵袭，而且还具有促进婴儿肠道局部和全身免疫系统成熟的作用，小部分母乳低聚糖还可减轻免疫应激反应和预防慢性炎症。另外，也有研究指出低聚糖与神经突触和神经传导关系密切，能促进婴儿的认知发育、增强学习和记忆能力；但母乳低聚糖在母乳中所占的比例只有千分之五到千分之十二，且母乳低聚糖的构成超过200多种，结构复杂，不利于母乳低聚糖的研究，对于母乳低聚糖的检测也设置了很大的难度，现今国内对于母乳低聚糖的研究相对滞后，检测母乳低聚糖的方法不仅耗时较长，而且不能对母乳低聚糖进行定量，提供一种快速检测母乳低聚糖，并可对低聚糖定量的方法是很有必要的。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，其可快速检测12种母乳低聚糖，并可对12种母乳低聚糖定量。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，主要包括以下步骤：步骤1、样品前处理：取150-250μl母乳，去除脂肪和蛋白质，取最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品。步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线。步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合所述标准曲线，进行定量分析，即得所述母乳低聚糖含量。所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以8-10mmol/L的甲酸铵溶液(A)和乙腈(B)为流动相；梯度洗脱程序为：0-10min，95％-75％B；10-15min，75％B；15-20min，75％-65％B；20-21min，65％-10％B；21-24min，10％B；24-25min，10-95％B；25-35min，95％B；流速为0.3mL/min，柱温40-60℃。优选的是，步骤1所述脂肪的去除采用离心的方式，以5000-7000r/min的速度在2-5℃下，将所述母乳离心8-12min后，去除上层脂肪；所述蛋白质的去除是在去除脂肪后的溶液中，加入400-700μL乙腈，涡旋混匀后超声8-12min，以8000-12000r/min的速度在2-8℃下离心8-12min，取上清液。优选的是，为进一步纯化所述上清液，将所述上清液再次离心，以8000-11000r/min的速度在2-6℃下离心6-10min，取最终上清液。优选的是，步骤3所述质谱采用电喷雾离子源；正离子扫描；所述质谱参数为：干燥气体温度：100-200℃，干燥气体流速：14-18L/min；雾化器压力：30-40psi；毛细管电压：2-5kV；保温气体温度：250-350℃；保温气体流速：10-15L/min。优选的是，所述测定的母乳低聚糖为12种低聚糖，所述低聚糖分别为：2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖、3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-N-岩藻五糖Ⅰ、乳酰-N-岩藻五糖Ⅲ、乳酰-N-二岩藻六糖Ⅱ、乳酰-N-己糖、二唾液乳-N-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c。优选的是，步骤3所述标准品为所述12种低聚糖标准品，所述标准品均取1-3mg，将其溶于1-3mL的超纯水中，混匀后得初级标准品溶液，置于-50--80℃储藏。优选的是，取所述初级标准品溶液建立不同浓度的标准品溶液。优选的是，所述不同浓度的标准品溶液的建立过程为：取所述2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖的初级标准品溶液各8-12μL，并各加入60-100μL超纯水，得两个混合标样，浓度均为100mg/L，取所述两个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度；取所述3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-N-岩藻五糖Ⅰ、乳酰-N-岩藻五糖Ⅲ、乳酰-N-二岩藻六糖Ⅱ、乳酰-N-己糖、二唾液乳-N-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c各2-8μL，并各加入30-80μL的超纯水混匀，得十个混合标样，浓度均为50mg/L，取所述十个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度。优选的是，根据所述不同浓度的混合标样，建立所述标准曲线。本专利技术至少包括以下有益效果：通过将样品前处理，并两次离心的方式，使母乳低聚糖溶液的纯度更高，一定程度保证了检测结果的准确度，并通过超高效液相色谱、质谱的方式，在标准品的基础上建立标准曲线，以同样的方式检测所述上样样品内的母乳低聚糖，并结合所述标准曲线得所述母乳低聚糖的含量，所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，更有利于母乳低聚糖分离，所述超高效液相色谱速度、灵敏度及分离度更高，大大缩短了分析时间，使得母乳低聚糖的检测更为快速，更加精准，再利用所述标准曲线，结合检测结果，可实现对所述12种母乳低聚糖定量，更利于母乳低聚糖领域研究的深入，本专利技术所述母乳低聚糖快速定性定量的方法可准确有效的检测12种母乳低聚糖，并可准确的得到所述12种母乳低聚糖的含量。本专利技术的其它优点、目，标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术所述的母乳低聚糖快速定性定量的方法的工艺流程图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。如图1所示，本专利技术提供一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，主要包括以下步骤：步骤1、样品前处理：取150-250μl母乳，去除脂肪和蛋白质，取最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品。步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线。步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合所述标准曲线，进行定量分析，即得所述母乳低聚糖含量。所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以8-10mmol/L的甲酸铵溶液(A)和乙腈(B)为流动相；梯度洗脱程序为：0-10min，95％-75％B；10-15min，75％B；15-20min，75％-65％B；20-21min，65％-10％B；21-24min，10％B；24-25min，10-95％B；25-35min，95％B；流速为0.3mL/min，柱温40-60℃。在上述方案中，步骤1通过将样品前处理，并两次离心的方式，使母乳低聚糖溶液的纯度更高，一定程度保证了检测结果的准确度，并通过超高效液相色谱、质谱的方式，在标准品的基础上建立标准曲线，以同样的方式检测所述上样样品内的母乳低聚糖，并结合所述标准曲线得所述母乳低聚糖的含量，所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，更有利于母乳低聚糖分离，所述超高效液相色谱速度、灵敏度及分离度更高，大大缩短了分析时间。一个优选方案中，步骤1所述脂肪的去除采用离心的方式，以5000-7000r/min的速度在2-5℃下，将所述母乳离心8-12m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，其中，主要包括以下步骤：步骤1、样品前处理：取150‑250μl母乳，去除脂肪和蛋白质，取最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品；步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线；步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合所述标准曲线，进行定量分析，即得所述母乳低聚糖含量。所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以8‑10mmol/L的甲酸铵溶液(A)和乙腈(B)为流动相；梯度洗脱程序为：0‑10min，95％‑75％B；10‑15min，75％B；15‑20min，75％‑65％B；20‑21min，65％‑10％B；21‑24min，10％B；24‑25min，10‑95％B；25‑35min，95％B；流速为0.3mL/min，柱温40‑60℃。

【技术特征摘要】
1.一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，其中，主要包括以下步骤：步骤1、样品前处理：取150-250μl母乳，去除脂肪和蛋白质，取最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品；步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线；步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合所述标准曲线，进行定量分析，即得所述母乳低聚糖含量。所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以8-10mmol/L的甲酸铵溶液(A)和乙腈(B)为流动相；梯度洗脱程序为：0-10min，95％-75％B；10-15min，75％B；15-20min，75％-65％B；20-21min，65％-10％B；21-24min，10％B；24-25min，10-95％B；25-35min，95％B；流速为0.3mL/min，柱温40-60℃。2.如权利要求1所述的母乳低聚糖快速定性定量的方法，其中，步骤1所述脂肪的去除采用离心的方式，以5000-7000r/min的速度在2-5℃下，将所述母乳离心8-12min后，去除上层脂肪；所述蛋白质的去除是在去除脂肪后的溶液中，加入400-700μL乙腈，涡旋混匀后超声8-12min，以8000-12000r/min的速度在2-8℃下离心8-12min，取上清液。3.如权利要求2所述的母乳低聚糖快速定性定量的方法，其中，为进一步纯化所述上清液，将所述上清液再次离心，以8000-11000r/min的速度在2-6℃下离心6-10min，取最终上清液。4.如权利要求1所述的母乳低聚糖快速定性定量的方法，其中，步骤3所述质谱采用电喷雾离子源；正离子扫描；所述质谱参数为：干燥气体温度：100-200℃，干...

【专利技术属性】
技术研发人员：芦晶，吕加平，陈新新，刘鹭，逄晓阳，张书文，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11