本发明专利技术公开一种生物人工近端小管装置，所述生物人工近端小管装置通过以下方法构成：制备脱细胞生物基质、用哺乳动物肾源性细胞和任选地哺乳动物内皮细胞来接种所述生物基质。接着，可对所述装置静态培养或利用生物反应器培养使其成熟，以允许肾脏细胞分化成功能近端小管细胞。所述装置能够执行近端小管功能。本申请还描述用于制造所述近端小管装置的各种方法。本申请还描述使用生物人工近端小管装置对小管细胞转运、各种化合物的毒性效应、或药物化合物筛选进行例如体外研究的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物人工近端小管系统及使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2011年5月27日提交的美国临时申请N0.61/490，890的权益，该申请内容全文以引用方式并入本文。
本专利技术一般涉及一种生物人工近端小管装置，所述生物人工近端小管装置包括生物支架和一种或多种祖细胞(例如哺乳动物肾源性细胞)，所述一种或多种祖细胞在所述支架上分化成肾近端小管细胞单层。本专利技术还涉及用于在生物反应器中制造和培养所述装置的方法。本专利技术还提供使用所述装置进行体外肾毒性或药物化合物筛选的方法。
技术介绍
慢性肾脏疾病(chronic kidney disease ；CKD)和终末期肾脏疾病(end-stagerenal disease ；ESRD)由肾脏功能的衰竭来界定,主要由肾小球滤过率来界定。这会导致肾脏不能排泄由身体产生的有毒代谢废物。在美国，CKD变得越来越普遍，与之伴随的是不良的健康结果和高的医疗成本。美国肾脏基金会估计2000万美国人患有CKD，且至少还有另外的2000万人民存在患上CKD的风险。ESRD则困扰着超过50万患者，而患有CKD的高危人群达到150万患者。用于CKD和ESRD的总成本占总医疗保险成本的几乎30%，然而这类患者仅占总医疗保险人口的8.1% (2008年美国肾病数据服务，2008年年度报告)。ESRD的发生率在过去的10年中增长了超过50%，且患有CKD或存在患上CKD风险的患者人数持续增长。因此，亟需能够修复损伤肾脏的新的治疗方式以及可判断所关注化合物的肾毒性的体外系统。许多异生物质或因降解产生的分子通过向滤液的主动运转而从血液中清除，所述滤液经由肾脏的肾近端小管细胞而被运往膀胱。作为执行这种重要功能的结果，肾近端小管细胞常常会由于这些化合物的毒性作用而`受损。因此，在体外系统中对潜在治疗性化合物的肾毒性测试已引起重大关注，此种测试可能会取代动物测试。当前用于测试肾近端小管上皮细胞单层形成和功能的基于细胞培养的模型利用原代细胞，或者已利用从各种源(例如MDCK (犬肾传代细胞)、LLC-PK1 (Lewis肺癌猪肾I)、或HK-2细胞)建立起的细胞系进行主要开发，所述细胞系是通过用人类乳头状瘤病毒16E6/E7基因转导而永生化的人类肾脏细胞系。利用这些细胞的测定系统通常利用多孔过滤器(例如Transwelli!过滤器)，所述多孔过滤器允许在细胞的顶点和基底外侧上发生流体接触，从而促进上皮细胞分化。然而，利用这些细胞系具有若干缺点。这些细胞系中有许多是从肿瘤转化或衍生而来的，可能会改变其生长、分化、并最终改变功能特性。此外，这些细胞系中有许多不是来自人类的。因此，这些细胞在功能上和对各种化合物的反应上可存在种族差异。原代细胞的使用是繁重的，这是因为细胞通常是新鲜分离的，且在用于实验之前进行最低限度地增殖。在不期望细胞群的污染下进行分离过程可为费力的。此外，供体来源材料可具有显著可变性。另一个常见的问题是原代细胞形成未受损单层的时间限制；此限制了进行体外研究的细胞实用性。原代细胞常常会过度生长、挣脱表面并形成三维聚集体，从而需要添加额外的因子(例如MEK抑制剂)来保持接触抑制(例如，如美国公开申请2009/0209019中所公开者)。多孔过滤器(例如Traiisweir过滤器)虽然有一定效果，但是由合成材料制成，因此不能精确地表示肾小管细胞在体内所通常暴露于其中的底层基质。其他人中已描述了依赖于三维小管结构的形成或依赖于对从动物分离的肾小管的培养的替代筛选方法，所述三维管结构的形成利用原代细胞在3D胶(例如MATRIGEL?)内的固态表面上的上述过度生长而形成(参见WO 2010/064995 Al)。后者由于费力的分离技术和所需考虑的物种差异而存在问题。这些替代方法的另一缺点在于，其仅能测定施加到培养基的外源化 合物向肾小管官腔中的转运。无法测定这些化合物对肾小管正常功能(例如葡萄糖重吸收或白蛋白摄取)的影响，这是因为不存在可靠的方法将标记的测试物质引入到管腔中或对肾小管的腔液进行取样以进行测定。此外，无法测定流的变化以及可能在各种体外情景中发生的生理动态条件的影响。因此，在本领域中需要开发一种能够更佳地反映肾近端小管上皮的正常生理机能的生物测定法。此最终能够开发出针对肾脏疾病的新的、更有效的疗法。
技术实现思路
本申请包括生物人工近端小管装置，所述装置具有脱细胞生物基质支架，在所述支架上由前体细胞(例如哺乳动物(例如人类)肾源性细胞)形成单层肾近端小管。本专利技术描述一种生物人工近端小管装置，所述生物人工近端小管装置通过以下方法构成:制备脱细胞生物基质、用哺乳动物肾源性细胞和任选地哺乳动物内皮细胞来接种所述生物基质。接着，可对所述装置静态培养或利用生物反应器培养使其成熟，以允许肾脏细胞分化成功能近端小管细胞。所得装置能够执行近端小管功能，例如能够将分子从生物膜的任一侧转运到另一侧。本专利技术还描述用于制造所述生物人工近端小管装置并使其成熟的各种方法。本专利技术还描述使用所述生物人工近端小管装置对小管细胞转运、各种化合物的毒性效应、或药物化合物筛选进行体外研究的方法。在一个实施例中，所述生物人工近端小管装置包括脱细胞生物基质支架，所述脱细胞生物基质支架在足以允许细胞分化成肾近端小管细胞的条件下用可分化成肾细胞的一种或多种细胞(例如可分化成肾细胞的前体细胞)来接种，其中这些分化细胞在所述支架上形成上皮细胞单层。所述生物人工近端小管装置还可任选地包括血管内皮细胞。在另一个实施例中，所述生物人工近端小管装置包括脱细胞生物支架，所述脱细胞生物支架具有至少两个表面，其中至少一个表面在足以允许细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下用可分化成肾细胞的一种或多种细胞(例如可分化成肾细胞的前体细胞)来接种，其中所述细胞在所述支架的表面上形成细胞单层。在替代实施例中，所述生物人工近端小管装置包括脱细胞生物支架和位于所述支架表面上的肾近端小管上皮细胞单层，所述脱细胞生物支架来源于哺乳动物组织且具有一个或多个表面，其中所述上皮细胞单层是通过以下方法形成:在足以允许肾源性细胞分化成肾近端小管细胞的条件下用一种或多种哺乳动物肾源性细胞来接种所述表面并形成单层。可在生物反应器中执行对所述表面的接种。此种生物反应器可具有上部本体元件、具有供细胞生长的区域的下部本体元件、和一个或多个连接器。所述可分化成肾细胞的一种或多种细胞(例如前体细胞)可为原代肾小管上皮细胞、诱导性多能干细胞或分化成肾细胞的祖细胞或肾祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、以及它们的混合物。在一个实施例中，所述可分化成肾细胞的一种或多种细胞是来自哺乳动物(例如人类)的肾源性细胞。这些肾源性细胞可从肾皮质、肾髓质、肾包膜下区域及其混合区域获得。在又一个实施例中，所述生物人工近端小管装置包括具有至少两个表面的脱细胞生物支架，其中在足以允许肾源性细胞分化成肾近端小管细胞的条件下用一种或多种哺乳动物肾源性细胞来接种至少一个表面，所述细胞在所述支架的表面上形成上皮细胞单层。所述哺乳动物可为人类，且所述细胞可从肾皮质、肾髓质或肾包膜下区域获得。在某些实施例中，所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物组织。所述支架可来源于哺乳动物组织(例如猪组织)。例如，所述支架本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生物人工近端小管装置，包括脱细胞生物基质支架，所述脱细胞生物基质支架在足以允许前体细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下用一种或多种前体细胞来接种，其中分化细胞在所述支架上形成上皮细胞单层。2.一种生物人工近端小管装置，包括脱细胞生物支架，所述脱细胞生物支架具有至少两个表面，其中至少一个表面在足以允许细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下用一种或多种前体细胞来接种，其中所述细胞在所述支架的表面上形成上皮细胞单层。3.根据权利要求1或2所述的生物人工近端小管装置，其中所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物组织。4.根据权利要求3所述的生物人工近端小管装置，其中所述脱细胞生物基质支架来源于粘膜或粘膜下组织。5.根据权利要求3所述的生物人工近端小管装置，其中所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物消化道。6.根据权利要求5所述的生物人工近端小管装置，其中所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物的胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。7.根据权利要求1至6中任一项所述的生物人工近端小管装置，其中所述一种或多种前体细胞选自:原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的诱导性多能干细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、以及它们的混合物。8.根据权利要求7所述的生物人工近端小管装置，其中所述祖细胞是人类肾源性细胞。9.根据权利要求8所述的生物人工近端小管装置，其中所述人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，并且对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxDU WT1、EyaU HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或⑶F5中的至少一种的表达为阳性；且对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。10.根据权利要求8或9所述的生物人工近端小管装置，其中所述人类肾源性细胞对细胞表面标志 HLA-1、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166 或 SSEA-4 中的至少一种为阳性；且对细胞表面标志 HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、⑶133、⑶138和⑶141中的至少一种为阴性。11.根据权利要求8至10中任一项所述的生物人工近端小管装置，其中所述人类肾源性细胞分泌营养因子FGF2、HGF、TGFa、--ΜΡ-1、--ΜΡ-2、ΜΜΡ_2或VEGF中的至少一种；且不分泌营养因子H)GF-bb或IL12p70中的至少一种。12.根据权利要求8所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：C卡札内基，DC科特，J香兹，A霍彭萨克，J汉斯曼恩，H瓦勒斯，
申请(专利权)人：德普伊新特斯产品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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