本发明专利技术涉及DNA定量检测方法和检测试剂盒。本发明专利技术建立了SYBR?Green?I荧光染料法对DNA定量的条件，得到了该方法的线性范围和灵敏度，可以快速、准确的得到DNA样品的精确含量。本发明专利技术还构建制备了质粒分子和基因组DNA标准品，采用数码PCR法对两种DNA标准品进行准确定量，利用该标准质粒或基因组DNA进行梯度稀释，得到SYBR?Green?I荧光染料法定量DNA的标准曲线，根据标准曲线得到待测DNA样品的准确含量。
【技术实现步骤摘要】
SYBR Green荧光染料DNA定量检测方法和试剂盒
:本专利技术涉及一种检测基因组DNA和质粒DNA的方法和检测试剂盒，特别是涉及一种SYBR Green I荧光染料DNA定量检测试剂盒。
技术介绍
:在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对基因组DNA和质粒DNA进行准确定量。采用Pic0Green荧光染料法对核酸进行定量，因其方法的灵敏度高、线性范围广，因此应用非常广。然而，PicoGreen荧光染料价格昂贵，且在对DNA进行定量时的局限性表现在方法的准确度高低取决于试剂盒中DNA标准品含量的准确度，而目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，这个值一般是通过紫外吸收(0D260)确定的，没有相关的不确定度信息和溯源性。其次，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的LambdaDNA标准。有报道称:以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏，现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。SYBR Green I荧光染料的与PicoGreen相比价格低。经我们的研究发现SYBRGreen I对双链DNA结合具有很好的效率，而结合单链DNA效率很低。目前，SYBR Green I荧光染料法普遍用于定量PCR扩增过程中与DNA结合或者通过染胶进行定量，还没有SYBRGreen I直接与质粒DNA或基因组DNA结合进行定量的方法与试剂盒。研制SYBRGreen I对DNA定量的试剂盒，需要具有准确量值的DNA标准物质，目前并没有含有准确量值的DNA标准可用作SYBR Green I法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低。基于单分子扩增的数字PCR方法可对DNA进行绝对定量，从而为SYBR GreenI荧光染料法提供DNA标准。
技术实现思路
:本专利技术的目的是提供一种DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒，该方法灵敏度高，线性范围广，准确度高，精密度好。为达到上述专利技术目的，本专利技术人进行了如下研究工作:1、SYBR Green I荧光染料对不同分子大小的DNA定量的线性关系选择了分子大小分别为5k，9k，48k的质粒/基因组分子作为研究对象，将DNA进行梯度稀释，稀释后的DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号；结果发现:荧光信号不仅与DNA浓度成正比(相关系数>0.99)，还与DNA分子大小相关，即分子量越大，线性相关曲线的斜率越大。 2、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA定量的线性范围将质粒DNA稀释至0.01ng/mL~10000ng/mL，与荧光染料结合后，测定荧光信号值；结果发现DNA浓度在0.05ng/mL~1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正t匕。因此，SYBR Green I对质粒DNA定量的线性范围为0.25ng/mL~1000ng/mL。3、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA的检测灵敏度由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为0.01ng/mL，加样量100 μ L ;因此计算出该方法的灵敏度为lpg。4、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA的定量限根据最低定量的线性范围，定量限为5pg。5、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA定量的线性范围将基因组DNA稀释至0.001ng/mL~10000ng/mL，与荧光染料结合后，测定荧光信号值，结果发现DNA浓度在0.01ng/mL~1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正比；因此，SYBRGreen I 对 Lambda DNA 定量的线性范围为 0.01ng/mL ~1000ng/mL。6、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA的检测灵敏度由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为0.005ng/mL，加样量100 μ L，因此计算出该方法的灵敏度为0.5pg。`7、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA的定量限根据最低定量的线性范围，定量限为lpg。根据以上研究，本专利技术首次建立了质粒和基因组SYBR Green I DNA荧光染料法定量检测方法，可对质粒或基因组DNA进行准确定量。本方法的步骤为:I)将待测样品稀释至DNA浓度为0.01~Ing/ μ L，与荧光染料混匀，用酶标仪读取所得到的荧光信号强度值；2)将标准品进行梯度稀释，得到4~8个DNA浓度的稀释液；取每一种浓度的标准品稀释液分别与荧光染料混匀后，用酶标仪分别读取每一种浓度所得到的荧光信号强度值；3)根据步骤2)得到的不同浓度DNA标准品的荧光强度值绘制标准曲线，根据此标准曲线计算待测样品DNA的浓度；其特征为:所用的标准品为用数字PCR法准确定量的环状质粒分子DNA或基因组DNA ;荧光染料是SYBR Green I。本方法中，用酶标仪读取荧光信号前，设置所述酶标仪激发波长480nm，吸收波长为 520nm。所述稀释用以下成分的工作液进行:10mM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8.0 ；进行步骤I)之前，采用紫外法测定待测DNA样品大致的浓度范围。步骤I)和步骤2)中，所用的荧光染料根据需要进行稀释，比如，在实施例中，规格10000X的SYBR Green I。使用前按照1:10000进行稀释。测定荧光信号强度时，稀释的待测样品与染料等体积混匀；每一种浓度的标准品稀释液分别与染料等体积混匀。本方法中，标准品稀释液的优选浓度分别为lng/μ L、0.5ng/y L、0.25ng/y L、0.lng/ μ L 和 0.01ng/ μ L。所述数字PCR法的具体操作如下:I)用紫外法测定待测物DNA的浓度，然后将此浓度根据分子量和阿伏加德罗常数从ng/ μ I换算成copy/ μ I,然后将DNA通过天平称量用ΤΕ0.1稀释至1200copies/ μ I备用；2)配置dPCR反应体系:取DNA模板2 μ 1，与8 μ I的PCR master mix混匀；3)将配置好的PCR体系加入芯片中对应的样品孔，转入芯片中的每个反应室；然后进行PCR扩增；4)数据处理:得到的数据结果进行分析处理，根据得到的阳性分子个数，利用泊松分布计算DNA浓度。根据上述方法，本专利技术提供了一种SYBR Green I荧光染料DNA定量检测试剂盒，包括:质粒DNA标准品，基因组DNA标准品，SYBR Green I荧光染料和工作液。所述工作液的成分是:10mM Tris-HCl，含 ImM EDTA，pH=8.0。本方法的创新点和优点是:1、首次采用标准质粒作为荧光染料法中的DNA标准对质粒样品进行定量；采用标准基因组DNA作为荧光染料法中的DNA标准对基因组DNA样品进行定量；2、弥补了现有商业化荧光染料试剂盒中不能对质粒DNA进行定量的缺点；3、方法灵敏度高:该方法可检测低至0.5pg的基因组本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种SYBR Green荧光染料DNA定量检测方法，步骤为: 1)将待测样品稀释至DNA浓度为0.01~Ing/yL，与荧光染料混匀，用酶标仪读取所得到的荧光信号强度值； 2)将标准品进行梯度稀释，得到4~8个DNA浓度的稀释液；取每一种浓度的标准品稀释液分别与荧光染料混匀后，用酶标仪分别读取每一种浓度所得到的荧光信号强度值； 3)根据步骤2)得到的不同浓度DNA标准品的荧光强度值绘制标准曲线，根据此标准曲线计算待测样品DNA的浓度； 其特征为:所用的标准品为用数字PCR法准确定量的环状质粒分子DNA或基因组DNA ；荧光染料是SYBR Green I。2.权利要求1所述的方法，用酶标仪读取荧光信号前，设置所述酶标仪激发波长480nm,吸收波长为520nm。3.权利要求1所述的方法,所述稀释用以下成分的工作液进行:IOmMTris-HCl，含ImMEDTA，pH=8.0。4.权利要求1所述的方法，进行步骤I)之前，采用紫外法测定待测DNA样品大致的浓度范围。5.权利要求1所述的方法，步骤I)和步骤2)中，所用的荧光染料的工作浓度为0.1uM,测定荧光信号强度时，稀释的待测样品与染料等体积混匀；每一种浓度的标准品稀释液分别与染料等体积混匀。6.权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：王泽广，吴立娟，董杰，
申请(专利权)人：王泽广，
类型：发明
国别省市：
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