含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用同源重组方法构建的含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒rVV‑CCL5‑SSTR2‑Luc+，该痘病毒的构建利用含人CCL5、SSTR2目的基因和Luciferase荧光素酶报告基因的穿梭质粒pSC65与痘病毒WR株具有相同的TK侧翼的特点，在痘病毒易感细胞BS‑C‑1中发生同源重组而将目的基因整合到痘病毒基因组中，实现重组痘病毒rVV‑CCL5‑SSTR2‑Luc+的构建任务；本发明专利技术制得的重组痘病毒rVV‑CCL5‑SSTR2‑Luc+能高效表达外源基因，同时CCL5与CIK细胞表面高表达的CCR5相匹配以及SSTR2定向诱导奥曲肽靶向肿瘤细胞具有独特优势，有利于在临床推广应用，用于各类肿瘤的治疗。

【技术实现步骤摘要】
含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒及其制备方法
本专利技术属于基因工程和肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒及其制备方法。
技术介绍
溶瘤痘病毒作为一种肿瘤治疗药物和基因治疗载体近年来发展迅速，痘病毒携带抗癌基因可提高其溶瘤效应，许多基因改造的靶向性溶瘤痘病毒相继进入临床试验，显示出广阔的应用前景。目前已进入临床试验的溶瘤痘病毒中，插入GM-CSF基因的Wyeth株重组痘病毒JX-594是最早进入临床试验的重组痘病毒，也是目前临床试验研究最多的重组痘病毒。在JX-594的已完成的Ⅰ、Ⅱ期临床试验中，并无明显客观疗效报道，为提高溶瘤痘病毒的疗效，Ⅲ期临床试验中JX-594瘤内注射联合化疗药物索拉菲尼协同抗肿瘤作用，该计划正在招募中，疗效还未可知。而进入临床试验的重组痘病毒给药方式为瘤内注射或静脉注射，由于各种免疫、生化或物理屏障的作用，导致病毒递送效率很低，病毒进入体内后很快被补体、抗病毒抗体及各种吞噬细胞等破坏，不能发挥有效的抗肿瘤作用，这也是之前的重组痘病毒未能发挥完全溶瘤作用的原因之一。CIK细胞具有向肿瘤组织聚集的特性，同时大量临床应用证明CIK细胞大剂量回输的安全性，用CIK细胞荷载重组痘病毒就显示出明显的优越性。而痘病毒的溶瘤潜能取决于所选择的病毒株，研究已显示，与Wyeth、Lister和Copenhangen株均具有溶瘤潜能，而WR株具有最强的溶瘤效应，显然与Wyeth等其它痘病毒株相比，痘病毒WR株具有更强的感染力和细胞裂解能力，并有悠久的实验室研究背景且完成了基因组全序列的测定，因此痘病毒WR株是作为构建重组痘病毒的首选。含人CCL5和人SSTR2基因的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒，其为含有人CCL5和人SSTR2基因的WR株重组痘病毒。本专利技术方法利用CCL5与CIK细胞表面高表达的CCR5相匹配的独特优势以及SSTR2可以定向诱导奥曲肽靶向抑制肿瘤的特点，可显著提高重组痘病毒的靶向溶瘤活性，使荷载重组痘病毒的CIK细胞免疫治疗的安全性得到保障，对CIK细胞荷载重组病毒联合奥曲肽靶向肿瘤细胞的免疫治疗在临床的推广应用起到了积极的作用。pSC65质粒具有与痘病毒TK基因同源的侧翼序列，可用作重组外源基因至痘病毒基因组的载体。将目的基因CCL5和SSTR2以及荧光素酶报告基因Luciferase克隆至pSC65中得到重组的痘病毒真核表达载体pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+，并与野生型痘病毒在细胞内进行同源重组得到重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+。上述含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒的制备方法，（1）分别以含人CCL5和人SSTR2cDNA序列的质粒为模板，采用如下引物进行PCR扩增，将PCR产物和pSC65质粒分别经内切酶酶切、电泳、切胶纯化回收，获得相应DNA片段，然后连接、转化，挑取阳性细菌克隆小提质粒，其中人CCL5基因插入p7.5启动子下游，人SSTR2基因插入pE/L启动子下游；阳性细菌克隆小提质粒经PCR、电泳和测序鉴定序列正确者命名为pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+；CCL5F：5’-AGCGCAGAGGGCAGTAGCAAT-3’CCL5R：5’-TGATGTACTCCCGAACCCA-3’；SSTR2F：5’-AAGCAGGCTGGTACCGGTCCGGAATTCCC-3’SSTR2R：5’-ATAGGCCGGCCAGGATCGATCCAGACATGAT-3’；（2）将pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+质粒与痘病毒WR株进行同源重组，然后筛选阳性重组子，经纯化、验证，最终获得含人CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+；（3）检测CIK细胞荷载重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+体外杀伤肿瘤的效应。重组痘病毒表达CCL5，与CIK细胞表面高表达的CCR5相匹配具有独特优势，且荷载该重组溶瘤痘病毒的CIK细胞高效杀伤肿瘤细胞后，释放出的溶瘤痘病毒能发挥二次杀伤肿瘤细胞的作用，随之所产生的在肿瘤区域稳定且持续的高浓度趋化因子CCL5使肿瘤细胞从无免疫原性变为强免疫原性，不但激活和增强机体的特异性抗肿瘤免疫反应，定向诱导T、NK细胞靶向杀伤肿瘤，同时，还将募集更多荷载了该重组溶瘤病毒的CIK细胞到达肿瘤部位，发挥“免疫/溶瘤”双重协同抗肿瘤作用。肿瘤细胞中是否有SSTR2基因的表达，及其表达水平的高低，将直接影响到SSA对肿瘤的治疗效果。其中，奥曲肽（Oct,SMS201-995）是最常用的SSA，能与SSTR2特异性结合。通过重组SSTR2基因的溶瘤病毒将其导入肿瘤细胞内，提高SSTR2在肿瘤细胞表面的表达水平，将精确定向并诱导奥曲肽到达肿瘤部位抑制肿瘤生长。构建含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒，后期实验中利用CIK细胞荷载该痘病毒，不仅避免重组痘病毒被机体免疫系统所清除，而且CIK细胞杀伤肿瘤后释放的携带抗癌基因CCL5和SSTR2的重组痘病毒，又可发挥二次杀伤肿瘤的效应，发挥出“细胞-基因-病毒”的协同抗肿瘤作用。本专利技术相对于现有技术的优点和技术效果如下：（1）本专利技术运用的分子水平技术简便易行，稳定可靠；（2）通过本专利技术制备得到的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+具有插入外源基因容量大而其遗传稳定性不受影响的优点；（3）通过本专利技术制备得到的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+在细胞质内复制增殖，并不掺入真核细胞基因组内，不受宿主基因组的影响；（4）通过本专利技术制备得到的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+是一种溶细胞病毒，复制周期快，细胞受感染后在三天内死亡，且宿主范围广，可在体外一定期限内不断扩大培养，且活性稳定，适用于批量生产；（5）本专利技术得到的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+自身携带一个失活的TK基因，用于增强病毒的肿瘤杀伤特异性；这一特性使得该溶瘤病毒不仅可利用肿瘤细胞自身表达的TK帮助病毒自身复制，直接发挥溶瘤作用；并且，由于其无法有效利用正常细胞内的复制装置，不能在正常细胞中进行复制，因此具有良好的安全性；（6）通过本专利技术制得重组痘病毒后，进行体外实验综合评估CIK细胞介导rVV-CCL5-SSTR2-Luc+联合奥曲肽靶向杀伤大肠癌细胞的疗效，为后期体内实验探讨CIK细胞介导rVV-CCL5-SSTR2-Luc+靶向治疗大肠癌发挥溶瘤效应的作用机制提供前期准备和实验基础。附图说明图1为重组质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+的琼脂糖凝胶电泳鉴定图，其中图A为CCL5-Luc片段（约2000bp）PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定图，泳道1：DNAMarker，泳道2-9：pSC65-CCL5-Luc单克隆PCR产物鉴定；图B为SSTR2片段（约1110bp）PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定图，泳道1：DNAMarker，泳道2-8：SSTR2单克隆鉴定PCR产物；图2为用同源重组方法构建重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的原理图；图3A为WB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒，其特征在于：为含有人CCL5和人SSTR2基因的WR株重组痘病毒。

【技术特征摘要】
1.一种含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒，其特征在于：为含有人CCL5和人SSTR2基因的WR株重组痘病毒。2.权利要求1所述的含CCL5和SSTR2基因的重组痘病毒的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：（1）分别以含人CCL5和人SSTR2cDNA序列的质粒为模板，采用如下引物进行PCR扩增，将PCR产物和pSC65质粒分别经内切酶酶切、电泳、切胶纯化回收，获得相应DNA片段，然后连接、转化，挑取阳性细菌克隆小提质粒，其中人CCL5基因插入p7.5启动子下游，人SSTR2基因插入pE/L启动子下游；阳性细菌克隆小提质粒经PCR、电泳和测序鉴定序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐慧，李丹洋，张锦锦，方敬敬，严新民，郭强，
申请(专利权)人：云南省第一人民医院，
类型：发明
国别省市：云南,53