一种大肠杆菌噬菌体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一株保藏编号为CCTCC NO:M 2017190的大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，该噬菌体为双链DNA，肌尾病毒科，具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部，在固体培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5‑1mm；该噬菌体对空间环境中肠出血性大肠杆菌，特别是mcr‑1阳性肠出血性大肠杆菌具有较好的消杀效果，应用于制备防治肠出血性大肠杆菌感染的药物中可实现广谱杀菌的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌噬菌体及其应用
本专利技术涉及生物工程领域，特别是一种肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1及其应用。
技术介绍
肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)是产志贺毒素大肠杆菌(Shiga-toxinproducingEscherichiacoli,STEC)的一类亚群,1982年被证实是一种重要的人畜共患病原菌,可以引起人不同程度腹泻、出血性结肠炎(Hemorrhagiccolitis,HC),溶血性尿毒综合症(Haemolyticuraemicsyndrome,HUS)等,严重的可导致死亡。肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichiacoli）广泛分布于自然界的土壤、水和农产品及林产品中，在人和动物的肠道及呼吸道内也常见，是典型的条件致病菌，常于动物抵抗力下降时引起暴发性流行，如鹅腹泻、家兔的肠炎、雏鸡腹泻、绵羊的传染性口炎、大熊猫的腹泻、猪腹泻等。青霉素类、头孢类和碳青霉烯类等β-内酰胺类药物是防治肠出血性大肠杆菌感染最主要的药物，其中青霉素类和头孢类药物在治疗肠出血性大肠杆菌感染中广泛使用，但由于长期的药物选择性压力，病原菌表现出了对这些药物严重的耐药性。华南农业大学刘健华教授和中国农业大学沈建忠教授（LiuYY,WangY,WalshTR,YiLX,ZhangR,SpencerJ,DoiY,TianG,DongB,HuangX,YuLF,GuD,RenH,ChenX,LvL,HeD,ZhouH,LiangZ,LiuJH,ShenJ.2016.Emergenceofplasmid-mediatedcolistinresistancemechanismMCR-1inanimalsandhumanbeingsinChina:amicrobiologicalandmolecularbiologicalstudy.LancetInfectDis16:161-168.）在动物和住院患者中发现多粘菌素耐药的新基因mcr-1（LiuYY,WangY,WalshTR,YiLX,ZhangR,SpencerJ,DoiY,TianG,DongB,HuangX,YuLF,GuD,RenH,ChenX,LvL,HeD,ZhouH,LiangZ,LiuJH,ShenJ.2016.Emergenceofplasmid-mediatedcolistinresistancemechanismMCR-1inanimalsandhumanbeingsinChina:amicrobiologicalandmolecularbiologicalstudy.LancetInfectDis16:161-168.）该基因由质粒所携带，可以在不同菌株间进行水平转移。此前仅报道过由基因突变导致的多粘菌素耐药，而这种耐药性是不会在细菌间进行传播的。由于多粘菌素被认为是对抗多重耐药细菌的最后一道防线，因此，质粒携带的mcr-1基因一经发现，立即引起全球广泛关注。根据该文献报道mcr-1基因主要存在于中国，可能已传播至东南亚国家，目前尚无良好的防控方法。噬菌体是一种杀灭细菌的病毒，寄生于细菌并利用细菌来复制繁殖，最后将细菌裂解死亡，由于其天然的杀菌特性，而被科学家认为是潜在的“超级细菌的有效克星”，而噬菌体对宿主细菌的特异性高、强大的裂解能力以及对人类和动物（产品）没有毒副作用、不会产生药物残留等优势而显示出了比抗生素更加广阔的应用前景和价值。噬菌体制剂的研制开发和应用无疑是解决这一问题的理想方法，在噬菌体产品开发方面，东欧一些国家已经批准某些噬菌体产品应用于人类皮肤金葡菌感染的治疗，美国也批准某些产品应用于动物性食品的表面消毒，如2006年美国FDA批准李斯特噬菌体制剂在禽产品和芝士上应用，用于消毒。目前利用噬菌体消杀环境中肠出血性大肠杆菌（特别是mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌）尚未见报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种能裂解肠出血性大肠杆菌的噬菌体vB_EcoM_C1，该噬菌体具有较宽的裂解谱，不仅可以裂解mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌，也可以裂解不携带mcr-1的肠出血性大肠杆菌，既可以裂解标准菌株ATCC25922，也可以裂解从环境中或者发病动物粪便中分离的肠出血性大肠杆菌临床株，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体消杀产品，本专利技术是这样实现的：一种大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，其保藏号为CCTCCM2017190；申请人将该噬菌体自命名为vB_EcoM_C1；该噬菌体具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部；噬菌体在1.2%的LB琼脂培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5-1mm；基因组核酸的酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA（dsDNA）；根据国际病毒分类委员会(ICTV)2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_EcoM_C1属于肌尾病毒科（Myoviridae）。该噬菌体在30-70℃中放置60min，活性稳定，在80℃中则失活；处于pH5.0-10.0时，其效价与初始效价无显著性差异。进一步，本专利技术所述肠出血性大肠杆菌噬菌体在制备防治由肠出血性大肠杆菌感染的药物（包括粉剂和液体剂型）中的应用，特别是在制备防治由mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌引起的动物腹泻药物中的应用，上述药物可以用于防治人和动物（鸡、猪、牛、鹅、鸭）肠出血性大肠杆菌感染。进一步，本专利技术所述肠出血性大肠杆菌噬菌体在杀灭环境中肠出血性大肠杆菌中的应用，特别是杀灭养殖场环境中mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌中的应用；所述养殖场环境是指畜禽体表、饲料、养殖器具、地面、墙面、粪便、垫料及其他空间环境。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：（1）肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1具有较强的杀灭活性和较宽的裂解谱，既可以特异性裂解mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌，也可以杀灭不含mcr-1基因的其它多重耐药的肠出血性大肠杆菌，应用于制备防治肠出血性大肠杆菌感染的药物中可实现广谱杀菌的效果。（2）该噬菌体vB_EcoM_C1经小鼠试验，毒副作用小，安全性高；由于mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成喷洒液、药浴液或注射液，对环境的mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌的污染可进行有效杀灭。附图说明图1.vB_EcoM_C1噬菌斑照片。图2.噬菌体vB_EcoM_C1的透射电镜照片。图3.温度对噬菌体vB_EcoM_C1活性影响示意图。图4.pH值对噬菌体vB_EcoM_C1活性影响示意图。图5.培养基中噬菌体vB_EcoM_C1杀菌效果示意图。图6.鹅料槽中噬菌体vB_EcoM_C1杀菌效果示意图。具体实施方式为方便理解本专利技术的技术方案，以下结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，下述实施例中所涉及的试剂、器材，若非特别说明，均由商业渠道购买获得。实施例涉及的菌株、试剂及培养基：实施例中涉及的宿主菌为mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌临床株，为江苏地区某鹅场病鹅腹泻粪便中分离得到，由江苏省农业科学院保藏。1mol/L无菌CaCl2溶液（1L）：用天平称量111gCa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，其保藏编号为CCTCC NO: M 2017190。

【技术特征摘要】
1.一株大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，其保藏编号为CCTCCNO:M2017190。2.如权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在制备防治肠出血性大肠杆菌感染药物中的应用。3.如权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在杀灭空间环境中肠出血性大肠杆菌中的应用。4.如权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在杀灭禽畜体表肠出血性大肠杆菌中的应用。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙利厂，王冉，葛展霞，何涛，庞茂达，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32