用于从生物流体中富集稀有细胞和生物标志物的具有平滑表面的微流体装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了微流体装置和来自生物流体样品的稀有细胞例如循环肿瘤细胞(CTC)以及包括蛋白质和DNA/RNA的其他生物标记物的富集和检测方法。所述装置通过对其细胞捕获室微流体在微米水平上进行优化设计以模拟天然光滑曲面例如海底或河床的平滑表面而相对现有微流体装置做出改进。所述平滑表面的特征在于创造温和的环境和增强样品混合以提高持续性的细胞‑抗体接触和稀有细胞的捕获，同时降低剪切力引起的细胞损伤。细胞捕获模块用细胞捕获配体包被。第二个可选配模块以高灵敏度结合非细胞生物标记物，在富集细胞生物标记物的同时富集非细胞生物标记物100至1000倍。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从生物流体中富集稀有细胞和生物标志物的具有平滑表面的微流体装置
本专利技术涉及微流体装置、细胞检测、细胞分离和分子生物标记物领域。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CTC)起源于原发性肿瘤并且可能来自转移部位。癌细胞从原发性肿瘤扩散到循环系统中作为向远端器官中转移的第一步。平均肿瘤每天可将估计数以百万计的细胞释放到血流中。Butler等，“ThePhysicalandfunctionalbehaviorofcaptureantibodiesadsorbedonpolystyrene”，“Immunol.Meth.,150：77-90(1992)”。大多数CTC不存活，但存活的那些CTC对宿主生物造成进一步癌症转移扩散的风险。转移是癌症患者死亡的首要原因。对于实体瘤，CTC的存在在疾病晚期是明显的，并且当转移性疾病位点已经建立时是最明显的。CTC的识别和表征提供了研究、监测和最终改变转移过程的机会。血液中未损伤的CTC是非常稀有的细胞，以每毫升(mL)全血存在1-10个CTC。相比之下，普通类型的血细胞以巨大的数目存在血液中，并且癌症可能改变其他类型血细胞的水平。这些其他类型细胞可以包括白细胞(正常约7百万/mL血液)和红细胞(正常约50亿/mL血液)。存在相当多这样的证据：CTC亚群可以指定为肿瘤进展和转移中的选定位点。(Norton等，“IsCanceraDiseaseofSelf-Seeding？，Nat.Med.,12(8)：875-878(2006)；Attard等，“CharacterizationofERG，ARandPTENgenestatusincirculatingtumorcellsfrompatientswithcastration-resistantprostatecancer.CancerRes.69(7)：2912-2918(2009)”)。治疗前循环肿瘤细胞的数目是转移性乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期的独立预测因子。Cristofanilli等，“Circulatingtumorcells，diseaseprogression，andsurvivalinmetastaticbreastcancer，NEnglJMed,2004；351(8):781-91”。关于血液组分的表征的进一步报告表明，在癌症患者的循环系统中存在更大数目的细胞碎片以及未损伤的CTC。肿瘤细胞碎片和完整CTC的计数可用于准确预测癌症患者的生存期。(AnnOncol.2010；21:1851-1857)一种现有的CTC芯片是蚀刻有78,000个具有50μm间距的交错排列的微柱的硅腔室。柱子涂有抗EpCAM抗体。CTC捕获产率限于约60％(Nagrath等，“Isolationofrarecirculatingtumorcellsincancerpatientsbymicrochiptechnology，Nature，450：1235-1239(2007”)。由于短的细胞柱接触时间造成的低捕获率和高剪切力导致的严重目标细胞损伤，“柱”样结构具有重大缺点。CTC的识别和表征可为研究、监测和最终改变转移过程提供了机会。然而，从血液中分离CTC而不造成破裂或其他损伤是困难的。大多数现有微流体系统的主要限制是，装置效率受到装置施加在血细胞和CTC上的剪切应力的限制。太大的剪切应力将破坏血细胞和CTC。当CTC破裂时，目标分离物(CTC本身)流失，CTC内部组分散落到流体中。当血细胞(主要是白细胞)破裂释放的细胞内物质进一步复杂化血液内的物种间的非特异性相互作用,使高纯度CTC提取变得更加困难。一些现有装置已经试图通过使用低通道微流体装置来减小剪切应力来避免破坏细胞，包括血细胞和CTC。然而，低通道导致流过通道的流体体积减小，进而导致非常低的流速。这样的装置不足以快速处理大量的血液以使其实用和有用。鉴于血液中未损伤CTC的极低丰度，快速处理大量(7-30mL)的血液(即，在24小时的窗口中[Stott等，“IsolationandCharacterizationofCirculatingTumorCellsfromPatientswithLocalizedandMetastaticProstateCancer，”Sci.Transl.Med.,2：25ra23(2010)；Meng等，“Circulatingtumorcellsinpatientswithbreastcancerdormancy，”ClinCancerRes.,10：8152-8162(2004)])是高产率分离完整CTC的先决条件。除了CTC，血液中循环的游离DNA(cfDNA)和肿瘤DNA(ctDNA)也已成为各种临床条件的癌症诊断和检测中的重要生物标志物。研究表明，cfDNA也许可用于转化基因组研究和监测基于特定肿瘤分布的个性化治疗。为了提取有价值的信息，至关重要的是能够从全血样品中高纯度提取和检测低水平的cfDNA。目前的研究集中于基于同时检测和表征CTC和cfDNA的血液分析。研究表明，在血液中检测到ctDNA的频率要比CTC高，ctDNA在检测突变中或许更有价值。和CTC作为预后生物标记不同的是，ctDNA能够提供治疗靶标(Madic等，Int.J.Cancer，136:2158-2165(2015))。上述微创、实时“液体活检”检测技术提供互补信息，可结合起来多次使用，，以监测疾病进展和定制癌症治疗方案。(Pantel等，CancerRes.,73(21):1-5(2013)；Haber等，CancerDiscov；4(6)：650-61(2014)；Kidess等，GenomeMedicine，5:70(2013))。
技术实现思路
作为本专利技术的一个方面，微流体装置包括：一个入口，一个出口，一个流体通道，和一个稀有细胞捕获模块；所述流体通道，在使用中流体在所述通道内流动，所述流体含有稀有量的全生物细胞分析物和非细胞生物标记物；所述细胞捕获模块，流体在所述入口与所述出口之间经由所述流体通道连通，所述稀有细胞捕获模块包括至少一个细胞捕获室，所述细胞捕获室底部由平滑轮廓特征的结构表面组成，所述平滑轮廓结构特征的表面的特征在于模拟天然流体自然形成的平滑表面形状分布及地貌轮廓。作为实施例的一种情形，所述稀有细胞捕获模块包括多于一个的所述细胞捕获室；每个所述细胞捕获室通过与其连通的通道与所述入口连通。作为实施例的一种情形，所述细胞捕获室具有等效尺寸和等效流速，或者，所述细胞捕获室中的至少一个细胞捕获室与其他细胞捕获室尺寸和流速不同。作为实施例的一种情形，所述天然流体自然形成的平滑表面形状分布及地貌轮廓包括海底、海洋地、河床；所述平滑轮廓结构特征的表面呈阵列；所述阵列分布包括微型凹谷阵列、微漏斗和微裂片阵列；其中：所述微型凹谷阵列具有10至1000微米宽、20至1000微米长和20至1000微米高的尺寸范围；阵列相对位置呈规律或不规律分布，间隙大小为5至500微米；所述微漏斗和微裂片阵列具有10至100微米宽、20至200微米长和20至200微米高的尺寸范围；所述阵列呈外切圆分布。作为本专利技术的微流体装置的表面特征的表面分布还可以包括如下表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流体装置，包括：a.入口；b.出口；c.封闭的流体通道和在操作中在所述通道内流动的生物流体，所述生物流体含有稀有量的全生物细胞分析物；和d.细胞捕获模块，其经由所述通道在所述入口与所述出口之间流体连通，所述细胞捕获模块包括至少一个细胞捕获室，所述细胞捕获室包括在所述室的底部的平滑特征表面，所述平滑特征表面的特征在于模拟天然水体的表面形状表面分布的平滑表面形状表面分布。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种微流体装置，包括：a.入口；b.出口；c.封闭的流体通道和在操作中在所述通道内流动的生物流体，所述生物流体含有稀有量的全生物细胞分析物；和d.细胞捕获模块，其经由所述通道在所述入口与所述出口之间流体连通，所述细胞捕获模块包括至少一个细胞捕获室，所述细胞捕获室包括在所述室的底部的平滑特征表面，所述平滑特征表面的特征在于模拟天然水体的表面形状表面分布的平滑表面形状表面分布。2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述细胞捕获模块包括多于一个具有平滑特征表面的细胞捕获室，每个捕获室通过所述通道与所述入口流体连通，并且所述平滑特征表面的特征在于模拟天然水体的表面形状表面分布的平滑表面形状表面分布。3.根据权利要求2所述的微流体装置，其中每个所述细胞捕获室具有相等的尺寸。4.根据权利要求2所述的微流体装置，其中所有所述细胞捕获模块具有相等的流速。5.根据权利要求2所述的微流体装置，其中所述细胞捕获室中的至少一个具有与其他细胞捕获室的尺寸不同的尺寸。6.根据权利要求1至5中任一项所述的微流体装置，其中所述细胞捕获室还包括在所述室的顶部的平滑特征表面。7.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中，天然水体的所述表面形状表面选自海底、海洋底和河床。8.根据权利要求7所述的微流体装置，其中所述平滑特征表面包括平滑特征阵列，每个所述平滑特征的特征在于分布。9.根据权利要求8所述的微流体装置，其中所述模拟基于数学上的平滑函数。10.根据权利要求9所述的微流体装置，其中所述模拟基于高斯函数。11.根据权利要求10所述的微流体装置，其中所述表面分布包括半峰宽度为10至5000微米的表面特征。12.根据权利要求8所述的微流体装置，其中所述表面分布增强所述表面上的细胞滚动。13.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布延长细胞表面相互作用。14.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布促进基于亲和力的稀有细胞分离。15.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布降低剪切应力。16.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布包括如下表面特征：最佳峰高度(“山”)、最佳谷深度(“凹谷”的深度)以及峰与谷之间的最佳斜率和曲率。17.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布促进所述细胞捕获室中的局部血液混合。18.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布有助于容易释放捕获的稀有细胞，同时维持细胞活力和完整性。19.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述微流体装置具有1至20毫升/小时的样品通量。20.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述微流体装置具有0.25毫升至50毫升的可变样品体积。21.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布减少光学干涉。22.根据权利要求1至6中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：董义，蒋春盛，
申请(专利权)人：美国迈迪威有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US