CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒。本发明专利技术发现肿瘤病人血清中CD19

【技术实现步骤摘要】
CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒
本专利技术涉及医学检测
，特别是涉及CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒。
技术介绍
肿瘤的早期诊断和治疗能显著提高肿瘤患者的存活率。英国癌症研究中心一项最新研究发现，如果能在早期得到诊断，癌症患者的生存几率会增加三倍。新研究中，英国癌症研究中心研究人员对英国乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肠癌、子宫癌、皮肤癌、卵巢癌和睾丸癌患者生存率情况展开了调查。这些癌症占英国所有癌症病例的40％以上。结果发现，大约一半的患者在癌症1期(癌症仅限于一个器官)和2期(癌症扩散至少临近小部分组织)确诊。另一半患者确诊时为3期(癌症已经扩散至腋窝淋巴结或胃部)和4期(癌症已扩到骨头、肝脏、大脑、肺脏或其他器官)。最终分析结果显示，在这8种常见癌症中，如果能在癌症1期(早期)确诊，10年生存率能达到90％。相比之下，癌症晚期(癌细胞扩散到骨骼、大脑、肺脏或其他重要器官)才确诊的患者，10年生存几率仅为25％，即患者生存期仅为5年。另外，以上消化道癌为例，通过胃镜加病理活检分析以后，如果确诊为早期，五年存活率可以高达80％-90％；但是如果它被发现时已经是晚期，五年存活率勉强能达到10％-20％。因此，开发癌症早期诊断高灵敏度新型标记物能够显著改善患者的预后。目前临床上常用的肿瘤诊断标志物包括甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和糖类抗原(CA199、CA125和CA153)，仅能检测到大约15-50％的任何阶段的肿瘤，对于疾病早期的检测则降至大约2-11％。而事实上，患者可能患有严重的需要立即注意的癌症。因此，迫切需要开发出一种具有高灵敏度的癌症诊断方法。外泌体(exosome，以下简写为EXO)是各种活细胞分泌的纳米级别的小囊泡，含有丰富的蛋白质、核酸和脂类成分，可广泛存在于人体的血液、唾液、母乳及尿液中(SoungYH,FordS,ZhangVandChungJ.ExosomesinCancerDiagnostics.Cancers.2017；9(1).)。有研究报道，外泌体中的EDIL3有希望成为早期乳腺癌的诊断标志物。细胞表面的蛋白聚糖Glypican-1存在于胰腺癌病人血清来源的外泌体，对早期胰腺癌的诊断具有绝对的特异性及灵敏度(MeloSA,LueckeLB,KahlertC,FernandezAF,GammonST,KayeJ,LeBleuVS,MittendorfEA,WeitzJ,RahbariN,ReissfelderC,PilarskyC,FragaMF,Piwnica-WormsDandKalluriR.Glypican-1identifiescancerexosomesanddetectsearlypancreaticcancer.Nature.2015；523(7559):177-182.)。微小RNAlet-7b和miR-18a在多发性骨髓瘤病人血清来源的外泌体中明显升高，可作为多发性骨髓瘤的诊断及预后的评价指标(ManierS,LiuCJ,Avet-LoiseauH,ParkJ,ShiJ,CampigottoF,SalemKZ,HuynhD,GlaveySV,RivottoB,SaccoA,RoccaroAM,BouyssouJ,MinvielleS,MoreauP,FaconT,etal.PrognosticroleofcirculatingexosomalmiRNAsinmultiplemyeloma.Blood.2017.)。可见，血清来源的外泌体在肿瘤的早期诊断中具有很好的前景。此外，血清来源的外泌体具有无创，易获取，检测方便，性价比高等特征，在未来肿瘤的早期诊断试剂的开发中，必将成为人们关注的热点。血清中的外泌体可来源于机体的各种细胞，包括各器官的上皮细胞、基质细胞和淋巴细胞等。虽然在肿瘤病人血清中，肿瘤来源的外泌体的比重会明显上升，但其它细胞尤其是淋巴细胞来源的外泌体在肿瘤病人血清中是否会上升尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术首次发现了人血清中CD19阳性的外泌体含量在肿瘤病人中显著升高，且在肿瘤不同分期时含量没有显著变化，所以该指标能够作为肿瘤诊断的标志物，特别是对于诊断难度较大的早期肿瘤具有良好的诊断效果。本专利技术搜集了健康人以及肿瘤病人血清(胃癌、肠癌、肺癌和乳腺癌)，并通过ELISA法对其中CD19+-EXO含量进行检测。对比健康人与肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量，获得最佳的cut-off值，评价血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤诊断的灵敏度与特异性；对比不同分期肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量是否具有差异性，评价该指标是否具有肿瘤早期诊断的价值；与目前临床上常用的肿瘤诊断标志物CEA进行对比，评价血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤的诊断是否具有高的灵敏度与特异性。发现了肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量要明显高于健康人。而且，不同分期肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量没有显著性差异，提示其在肿瘤早期诊断中的价值。与CEA相比，通过检测血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤的诊断，在灵敏度与特异性方面均显著优于CEA。对已确诊为肿瘤患者的验证性实验中，通过检测血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤的检出率要显著高于CEA。以上结果表明，检测人体血清中CD19+-EXO的含量在肿瘤早期诊断中的应用前景。此外，在消化道肿瘤胃癌及肠癌的诊断中，通过检测血清中CD19+-EXO的含量来诊断肿瘤的灵敏度与特异性均可达到80％左右。在我国常规体检项目中，往往不包括胃、肠镜的检查。因此，通过检查人体血清中CD19+-EXO的含量，如发现该指标有显著升高的个体，可建议进行胃、肠镜的检查，从而增加早期胃、肠癌的检出率。本专利技术提供了CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。优选的，所述肿瘤为胃癌、肠癌、肺癌或乳腺癌。优选的，所述肿瘤为早期肿瘤。本专利技术还提供了一种基于检测血清中CD19阳性外泌体含量的肿瘤诊断试剂盒，包括用于捕获外泌体的包被抗体、抗CD19抗体、PBST缓冲液、封闭液、Avidin-HRP、二甲基联苯胺以及反应终止液。使用ELISA法检测：先通过包被抗体包被96孔酶标版；然后使用PBST缓冲液(含吐温的PBS缓冲液)洗板；用封闭液进行封闭，封闭液常用含10％胎牛血清的PBS缓冲液；再次用PBST缓冲液洗板后，加入待检测的血清，孵育；用PBST缓冲液洗板后，加入抗CD19抗体孵育；用PBST缓冲液洗板后，加入Avidin-HRP(亲和素标记的辣根过氧化物酶)孵育；用PBST缓冲液洗板后，加入底物二甲基联苯胺进行显色反应；加入反应终止液终止显色反应，反应终止液可以选择常用的1N的H2SO4溶液；检测450nm处吸光度(OD)值。优选的，用于捕获外泌体的包被抗体为抗Rab5b抗体。优选的，所述肿瘤诊断试剂盒还包括浓度已知的CD19阳性外泌体标准品。更优选的，所述外泌体标准品通过培养B淋巴细胞瘤细胞株Raji细胞获得。Raji细胞分泌的外泌体表面CD19表达水平较高，可以作为检测血清中CD19阳性外泌体数量时的阳性对照，并用于获得CD19阳性的外本文档来自技高网...

【技术保护点】
CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为胃癌、肠癌、肺癌或乳腺癌。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为早期肿瘤。4.一种基于检测血清中CD19阳性外泌体含量的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，包括用于捕获外泌体的包被抗体、抗CD19抗体、PBST缓冲液、封闭液、Avidin-HRP、二甲基联苯胺以及反应终止液。5.如权利要求4所述的肿瘤诊断试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡志坚，王建莉，张方慧，杨云山，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33