蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供了一种蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法，包括：用荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体、荧光标记的抗CD8抗体、荧光标记的抗CD56抗体、荧光标记的抗CD16抗体、荧光标记的抗IFN‑γ抗体、荧光标记的抗IL‑4抗体、和Fixable Viability Dye对同一份待检测蜕膜淋巴细胞样品进行荧光染色，得到染色后样品；将染色后样品经流式细胞术检测，得到检测数据；以及分析检测数据。该方法所需蜕膜淋巴细胞样品较少，节省抗体，且操作简单。此外还提供了采用该方法的试剂盒及该试剂盒在反复自然流产的免疫学检测中的应用。

【技术实现步骤摘要】
蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法、试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种淋巴细胞亚型的检测方法，尤其是一种通过流式细胞术检测蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法、采用该方法的试剂盒及该试剂盒在反复自然流产的免疫学检测中的应用。
技术介绍
自然流产是早期妊娠最常见的并发症。反复自然流产(recurrentmiscarriage,RM)是指两次及两次以上的自然流产，发病率占育龄妇女的1％-2％。目前RM的病因主要包括：亲代或子代染色体异常、子宫解剖结构异常、内分泌紊乱、感染以及母体自体免疫，但仍有许多不明原因反复自然流产(unknownrecurrentmiscarriage,URM)的发病原因未知。母胎之间存在免疫耐受现象，这种免疫耐受的破坏被认为是RM的病因之一。免疫治疗改善了一部分RM患者的妊娠结局，但荟萃分析显示已有的免疫治疗方案对于RM患者总体的妊娠结局没有明显的优势。因此如何阐述母胎界面的免疫耐受现象成为提高RM患者妊娠结局的前提。在母胎免疫中，T淋巴细胞亚群失衡以及NK细胞(NaturalKillerCell,NK)介导的免疫反应被认为是RM的可能机制。成熟的T淋巴细胞表达CD3，并可按功能分为表达CD4的Th细胞亚群(Thelperlymphocyte,Th)和表达CD8的Tc细胞亚群(cytotoxicTlymphocyte，Tc)。Th细胞亚群可以按其分泌的细胞因子分为Th1、Th2功能亚群。抗原和IL-12介导Th1亚群分化，分化后的Th1主要分泌IFN-γ和TNF-α等1型细胞因子促进细胞免疫应答。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等2型细胞因子介导体液免疫。蜕膜NK细胞(dNK细胞)也可以分泌1型和2型细胞因子，其中蜕膜NK1细胞(dNK1细胞)主要分泌IFN-γ和TNF-α等1型细胞因子，蜕膜NK2细胞(dNK2细胞)主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等2型细胞因子。然而，dNK细胞不表达CD3，高表达CD56，不表达CD16，可以通过这三个表型与T淋巴细胞或外周血NK细胞鉴别。Th1/Th2和dNK1/dNK2的构成与RM存在相关性，因此可以通过检测这些细胞的构成来反映RM母胎界面真实的免疫反应状况，从而识别免疫病因的存在并指导下一步治疗。目前主要通过流式细胞术的方法来检测RM患者蜕膜淋巴细胞亚型。普通方法多采用三色或四色抗体组合分别检测Th和dNK细胞的亚型，一般采用2管4色抗体组合，如利用CD3、CD4、CD8和一个细胞因子的4色组合检测Th1和Th2亚型，利用CD3、CD56、CD16和一个细胞因子的4色组合检测dNK1和dNK2亚型，若要检测更多亚型，则需要更多抗体组合，因此该方法需要对同一蜕膜组织的多份淋巴细胞样品进行不同抗体组合的染色。这种方法消耗的抗体量较多，操作步骤以及工时多，反复使用多种抗体对患者进行全面的抗原分析，费用较高。同时对待检测蜕膜淋巴细胞样品的需求量较大，需要采集足够量的蜕膜组织才能完成检测，然而患者的蜕膜组织需要在无菌环境中通过手术获取，经过分离得到的淋巴细胞数量有限。这些问题给RM患者蜕膜淋巴细胞亚型检测带来许多不便。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法，其所需蜕膜淋巴细胞样品较少，且操作简单，节省抗体。本专利技术的另一个目的是提供一种检测蜕膜淋巴细胞亚型的试剂盒，使用其检测蜕膜淋巴细胞亚型时所需蜕膜淋巴细胞样品较少，且操作简单，节省抗体。本专利技术的还一个目的是提供检测蜕膜淋巴细胞亚型的试剂盒在反复自然流产的免疫学检测中的应用，使用该试剂盒检测蜕膜淋巴细胞亚型时所需蜕膜淋巴细胞样品较少，且操作简单，节省抗体。本专利技术提供了一种蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法，其包括：用荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体、荧光标记的抗CD8抗体、荧光标记的抗CD56抗体、荧光标记的抗CD16抗体、荧光标记的抗IFN-γ抗体、荧光标记的抗IL-4抗体、和FixableViabilityDye对同一份待检测蜕膜淋巴细胞样品进行荧光染色，得到染色后样品；将染色后样品经流式细胞术检测，得到检测数据；以及分析检测数据。其中，荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体、荧光标记的抗CD8抗体、荧光标记的抗CD56抗体、荧光标记的抗CD16抗体、荧光标记的抗IFN-γ抗体、荧光标记的抗IL-4抗体、和FixableViabilityDye在流式细胞术检测时，可具有不同的发射光波长。本专利技术提供的蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法，仅需对同一份蜕膜淋巴细胞样品进行针对CD3、CD4、CD8、CD56、CD16、IFN-γ和IL-4的荧光染色及FixableViabilityDye染色，即可实现对蜕膜淋巴细胞多个亚型的分析，该方法所需蜕膜淋巴细胞样品较少，节省抗体，且操作简单。在蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法的另一种示意性实施方式中，还设置对照组和同型对照组。设置对照组的意义在于排除无关变量的影响，增加实验结果的可信度和说服力；设置同型对照组的意义在于区别抗体染色过程中相同亚型所造成的背景信号影响。在蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法的再一种示意性实施方式中，荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体、荧光标记的抗CD8抗体、荧光标记的抗CD56抗体、荧光标记的抗CD16抗体、荧光标记的抗IFN-γ抗体、和荧光标记的抗IL-4抗体的荧光标记依次为PerCP、APC、FITC、PE-Vio770、VioBlue、APC-Vio770和PE；FixableViabilityDye为FixableViabilityDyeeFluor506。在蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法的又一种示意性实施方式中，荧光染色的步骤包括：将待检测蜕膜淋巴细胞样品与荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体、荧光标记的抗CD8抗体、荧光标记的抗CD56抗体、荧光标记的抗CD16抗体、和FixableViabilityDye共孵育，得到中间样A；对中间样A进行细胞固定和透膜处理，得到中间样B；以及将中间样B与荧光标记的抗IFN-γ抗体和荧光标记的抗IL-4抗体共孵育，得到染色后样品。藉此可有效地对胞内及胞外细胞标志物进行荧光标记。在蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法的又一种示意性实施方式中，分析的方法包括：细胞标志CD3-CD56++CD16-IFN-γ+IL-4-代表蜕膜NK1细胞亚群，细胞标志CD3-CD56++CD16-IFN-γ-IL-4+代表蜕膜NK2细胞亚群，细胞标志CD3+CD56-CD4+CD8-IFN-γ+IL-4-代表Th1细胞亚群，细胞标志CD3+CD56-CD4+CD8-IFN-γ-IL-4+代表Th2细胞亚群，细胞标志CD3+CD56-CD4-CD8+IFN-γ+IL-4-代表Tc1细胞亚群，细胞标志CD3+CD56-CD4-CD8+IFN-γ-IL-4+代表Tc2细胞亚群，细胞标志CD3+CD56+IFN-γ+IL-4-代表NKT1-like细胞亚群，细胞标志CD3+CD56+IFN-γ-IL-4+代表NKT2-like细胞亚群。在蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法的又一种示意性实施方式中，分析的方法包括：a.建立FSC/FixableViabilityDye密度图，将在伪彩图显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法，其特征在于，包括：用荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体、荧光标记的抗CD8抗体、荧光标记的抗CD56抗体、荧光标记的抗CD16抗体、荧光标记的抗IFN‑γ抗体、荧光标记的抗IL‑4抗体、和Fixable Viability Dye对同一份待检测蜕膜淋巴细胞样品进行荧光染色，得到染色后样品；将所述染色后样品经流式细胞术检测，得到检测数据；以及分析所述检测数据；其中，所述荧光标记的抗CD3抗体、所述荧光标记的抗CD4抗体、所述荧光标记的抗CD8抗体、所述荧光标记的抗CD56抗体、所述荧光标记的抗CD16抗体、所述荧光标记的抗IFN‑γ抗体、所述荧光标记的抗IL‑4抗体、和所述Fixable Viability Dye在所述流式细胞术检测时，可具有不同的发射光波长。

【技术特征摘要】
1.一种蜕膜淋巴细胞亚型的检测方法，其特征在于，包括：用荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体、荧光标记的抗CD8抗体、荧光标记的抗CD56抗体、荧光标记的抗CD16抗体、荧光标记的抗IFN-γ抗体、荧光标记的抗IL-4抗体、和FixableViabilityDye对同一份待检测蜕膜淋巴细胞样品进行荧光染色，得到染色后样品；将所述染色后样品经流式细胞术检测，得到检测数据；以及分析所述检测数据；其中，所述荧光标记的抗CD3抗体、所述荧光标记的抗CD4抗体、所述荧光标记的抗CD8抗体、所述荧光标记的抗CD56抗体、所述荧光标记的抗CD16抗体、所述荧光标记的抗IFN-γ抗体、所述荧光标记的抗IL-4抗体、和所述FixableViabilityDye在所述流式细胞术检测时，可具有不同的发射光波长。2.如权利要求1所述的检测方法，其中所述荧光染色的步骤包括：将所述待检测蜕膜淋巴细胞样品与所述荧光标记的抗CD3抗体、所述荧光标记的抗CD4抗体、所述荧光标记的抗CD8抗体、所述荧光标记的抗CD56抗体、所述荧光标记的抗CD16抗体、和所述FixableViabilityDye共孵育，得到中间样A；对所述中间样A进行细胞固定和透膜处理，得到中间样B；以及将所述中间样B与所述荧光标记的抗IFN-γ抗体和所述荧光标记的抗IL-4抗体共孵育，得到所述染色后样品。3.如权利要求1所述的检测方法，其中所述分析的方法包括：a.建立FSC/FixableViabilityDye密度图，将在伪彩图显示模式下最靠近右下方的细胞群落设门标记为P1；b.对所述P1内细胞依次通过SSC-H/SSC-W和FSC-H/FSC-W设门去除粘连体；c.对去除粘连体后的细胞群以CD3/CD56十字门设门；d.对CD3-CD56+细胞群以CD56/CD16设门，对CD56++CD16-细胞群经椭圆门设门，所得细胞群为蜕膜NK细胞亚群；e.对CD3+CD56-细胞群以CD4/CD8十字门设门，所得CD4+CD8-细胞群为Th细胞亚群，所得CD4-CD8+细胞群为Tc细胞亚群；CD3+CD56+细胞群为NKT-like细胞亚群；以及f.对所述Th细胞亚群、所述Tc细胞亚群、所述蜕膜NK细胞亚群和所述NKT-like细胞亚群分别以IFN-γ/IL-4十字门设门，所得IFN-γ+IL-4-细胞群为相应的1型亚群，所得IFN-γ-IL-4+细...

【专利技术属性】
技术研发人员：董鹏，李坚，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京妇产医院，首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：北京,11