本发明专利技术公开了一种5‑氟尿嘧啶血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒。所述试剂盒包括校准品5‑FU，校准品稀释液，铕标5‑FUA‑OVA抗原，抗5‑FU鼠源多克隆抗体，分析缓冲液，洗涤液，增强液，羊抗鼠IgG包被反应板。本发明专利技术的试剂盒可定量测定化疗后患者外周血中5‑FU的血药浓度，其测试结果显示，本发明专利技术的试剂盒灵敏度高，灵敏度为2.1ng/ml，稳定性好，重复性好，省时高效，操作简便、检测范围宽、无放射性污染等特点，有利于化疗药物即时监测的实现，适合用于临床氟尿嘧啶类药物血药监测，指导临床用药。
【技术实现步骤摘要】
一种实时监测5-氟尿嘧啶血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒
本专利技术涉及医学生物技术与分子诊断领域，具体地，涉及一种实时监测5-氟尿嘧啶血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒。
技术介绍
5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是一种广谱、高效的治疗消化道和呼吸系统肿瘤的首选药，以5-FU为基础的联合用药也是结直肠癌术后的标准辅助治疗。虽然5-FU的疗效显著，但存在骨髓抑制，黏膜炎等毒副作用，限制了其临床应用。临床药物流行病学调查显示，其毒副作用存在明显的个体差异，这与其体内的分解代谢限速酶-二氢嘧啶脱氢酶(Dihydropyrimidinedehydrogenase,DPD)不同的个体表达水平有关。剂量累积的毒性作用可能影响5-FU的药物代谢，研究表明，5-FU的药物浓度-时间曲线下面积(AUC)为:8.7±4.1h×mg/L；清除率(CL)为:51.5±24.8L/h/m2；表观分布容积(Vd):18.0±15.2L/m2；半衰期(t1/2):0.26±0.19h；血药峰值(Cmax):21.0±14.9mg/L。血浆中稳态药物浓度在25～25,000ng/mL，个体差异大。大多数药物的疗效与该药到作用部位的浓度或相关受体浓度密切相关，而药物在受体部位的浓度直接与血药浓度有关，两者呈现平行关系，因此，血药浓度的测定可作为间接衡量药物在作用部位或受体浓度的指标。大量研究表明，等同体重给药(mg/kg)或体表面积给药(mg/m2)下的稳态血药浓度在个体间存在显著差异，仅仅根据体表面积给药，大部分患者未能达到最优的药物暴露量。而基于的药物剂量选择，将稳态血药浓度维持在一定水平，能够使患者在疗效和毒性之间获得最佳平衡。因此，需要建立一套简便即时的血药监测方法来控制有效药物浓度。临床上5-FU的血药监测手段主要有紫外检测-高效液相色谱法(UV-HPLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用色谱(GC-MS)和液质联用色谱(LC-MS/MS)以及紫外分光光度法。色谱质谱定量所需血清样本量大，且检测前须对样本前处理，操作复杂繁琐，检测时间长，不符合即时监测及难以推广应用。紫外分光光度法同样样品需求量大、灵敏度低、抗干扰能力差、专属性差，临床普及意义不大，已逐渐被淘汰。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供一种实时监测5-氟尿嘧啶血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒。本专利技术需要对试剂盒所使用的原料进行制备与筛选，从而确定最佳原料，这一过程包括人工抗原的合成及偶联比的确定，多克隆抗体的制备，标记物和抗体的比例，包被抗体的浓度，标记物的稀释度，包被板的吸附性能和变异大小等。通过反复摸索和比对，确定了小分子人工抗原标记和纯化的最佳条件。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的。一种实时监测5-氟尿嘧啶血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒，包括浓度为0、10、50、100、750、1500ng/mL的校准品5-FU、校准品稀释液、铕标5-FUA-OVA、抗5-FU鼠源多克隆抗体、分析缓冲液、洗涤液、增强液、羊抗鼠IgG包被的反应板；所述铕标5-FUA-OVA中5-FUA-OVA与Eu3+标记物的质量比为5:1，所述5-FUA-OVA中5-FUA与OVA的偶联质量比为10:1；所述抗5-FU鼠源多克隆抗体制备使用的抗原为5-FUA-KLH，所述5-FUA-KLH中5-FUA与KLH偶联摩尔比为20:1。优选地，所述校准品稀释液为含有2mg/ml的BSA及0.1％NaN3的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液。根据本专利技术一个优选的实施方案，包被反应板为按每孔0.5ug羊抗鼠IgG，100ul包被缓冲液加入96孔透明微孔板，并封闭冻干制备而成。其中封闭液成分为50mMTris-HCl，0.1％BSA、4％海藻糖、0.05％NaN3，pH7.2。优选地，所述分析缓冲液成分为50mM、pH7.8的Tris-HCl，1.5％PEG6000，0.2％BSA，0.1％Proclin300，0.02％牛IgG，0.1％Tween20和0.84％NaCl。优选地，所述洗涤液成分为1.25mmol/LpH7.8Tris-HCl，2.5％Tween20和21％NaCl。优选地，所述增强液成分为15umol/Lβ-萘甲酰三氟丙酮，50umol/L三辛基氧化磷，0.1％TritonX-100，0.6％醋酸，用邻苯二甲酸氢钾调整pH3.0～3.2。优选地，所述5-FUA-OVA的制备方法为：将5-FUA溶于MES溶液中，加入EDC和NHS对其进行活化，活化后的5-FUA与溶于磷酸盐缓冲液的载体蛋白OVA偶联并纯化优选地，所述铕标5-FUA-OVA抗原的制备方法，包括如下步骤：S1.向5-FUA-OVA中加入Eu3+标记试剂，充分混匀，25℃振荡过夜；S2.用层析柱分离纯化，用洗脱液洗脱，收集流出液，逐管测量吸光度，合并峰管，测蛋白含量并计算标记率；S3.稀释并管后的标记物，分装真空冷冻干燥。优选地，所述铕标记5-FU-OVA合成抗原的制备步骤如下：(1)抗原纯化和浓缩：1mg5-FUA-OVA合成抗原，用市售的带有滤膜的G-10离心管9000rpm离心5min，弃滤液，并加入200ul标记缓冲液(50mmol/L,Na2CO3,pH9.0)重复洗涤6次，倒转G10离心管，1500rpm离心2min收集抗原。(2)抗原标记：往纯化好的5-FU-OVA抗原中加入0.2mgEu3+标记试剂，充分混匀，25℃振荡过夜。(3)上样与洗脱：用SephadexG-50层析柱(1×30cm)分离纯化，洗脱液(含0.9％NaCl的50mmol/LTris-HCl)洗脱，同时收集流出液(1ml/管)，逐管测量吸光度(A280)，合并峰管，测蛋白含量并计算标记率。(4)确定稀释度：并管后的铕标记物，进行稀释度摸索，选择线性较好，灵敏度较好的稀释度；优选稀释度为1/200，以此为基准稀释并管后的标记物。(5)分装标记物：分装体积为1.0ml/瓶，真空冷冻干燥。(6)保存：冻干后在2～8℃条件下保存。优选地，所述抗5-FU鼠源多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：S1.5-FUA-KLH抗原的制备：将KLH溶解于磷酸盐缓冲液中，将5-FUA溶于MES溶液中，往5-FUA溶液中加入EDC和NHS，室温活化30min，将KLH加入反应液中，37℃避光反应过夜，用磷酸盐缓冲液透析24h，分装冻干；S2.小鼠免疫：纯水溶解5-FUA-KLH抗原，免疫方式采用皮下多点注射免疫，每只Balb/c小鼠接种剂量为50μg，三周后同样对小鼠皮下多点注射，加强免疫2次；S3.测定血清效价，血清效价高于1/128000时，收集小鼠血清，分装保存。血清效价测定的具体方法为：取小鼠尾静脉血，9000rpm，离心10min，取上清，对小鼠血清的效价测定采用时间分辨荧光免疫分析法，将5-FUA-OVA抗原溶于包被液中，37℃振荡孵育1h，拍干，加入封闭液，4℃封闭过夜，拍干，加入小鼠血清，37℃孵育2h，洗涤液洗4次，加入铕标羊抗鼠IgG，置37℃孵育1h，洗涤液洗6次，加入增强液，37℃孵育5min，测值；利用上述试剂盒检测5-FU血药浓度的方法，包括如本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种实时监测5‑氟尿嘧啶血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒，包括其特征在于，包括浓度为0、10、50、100、750、1500 ng/mL的校准品5‑FU、校准品稀释液、铕标5‑FUA‑OVA、抗5‑FU鼠源多克隆抗体、分析缓冲液、洗涤液、增强液、羊抗鼠IgG包被的反应板；所述铕标5‑FUA‑OVA中5‑FUA‑OVA与Eu
【技术特征摘要】
1.一种实时监测5-氟尿嘧啶血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒，包括其特征在于，包括浓度为0、10、50、100、750、1500ng/mL的校准品5-FU、校准品稀释液、铕标5-FUA-OVA、抗5-FU鼠源多克隆抗体、分析缓冲液、洗涤液、增强液、羊抗鼠IgG包被的反应板；所述铕标5-FUA-OVA中5-FUA-OVA与Eu3+标记物的质量比为5:1，所述5-FUA-OVA中5-FUA与OVA的偶联质量比为10:1；所述抗5-FU鼠源多克隆抗体制备使用的抗原为5-FUA-KLH，所述5-FUA-KLH中5-FUA与KLH偶联摩尔比为20:1。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述5-FUA-OVA的制备方法为：将5-FUA溶于MES溶液中，加入EDC和NHS对其进行活化，活化后的5-FUA与溶于磷酸盐缓冲液的载体蛋白OVA偶联并纯化。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述铕标5-FUA-...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴英松，刘天才，林冠峰，梁君瑜，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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