一种利用DNA探针配体电化学检测STAT 3蛋白活化水平的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用DNA探针配体电化学检测STAT 3蛋白活化水平的方法和应用。本发明专利技术利用STAT 3这一重要的转录因子和DNA以及多肽这两种天然配体间动态可逆可控的相互作用，设计了特异性识别蛋白质的DNA探针，利用多肽来控制靶标蛋白STAT 3和DNA探针间可逆性的结合和解离，通过Zr

【技术实现步骤摘要】
一种利用DNA探针配体电化学检测STAT3蛋白活化水平的方法和应用
本专利技术属于分子诊断与产科高危妊娠检测领域，涉及一种利用DNA探针配体电化学检测STAT3蛋白活化水平的方法和应用。
技术介绍
目前，对于蛋白质活化水平的检测分析主要依靠的仍然是传统的免疫学方法如WesternBlotting和ELISA等；STAT3蛋白活化水平的检测也主要是通过这两种方法。但这些依赖于抗原抗体识别机制的经典方法存在着不同程度的局限性，如抗体高度复杂的化学结构、繁复的制备工艺和昂贵价格、操作繁琐，费时且需要接触放射性物质等。随着对疾病相关的蛋白质标记物特异性检测兴趣的与日俱增，除了基于抗原-抗体结合的免疫分析，另一类基于核酸适配体化学合成配基的蛋白质生物传感器也得到了巨大的关注，尽管两者互相补充相辅相成，但对蛋白质标记物活化水平的检测在灵敏度、选择性、响应速度等诸多方面仍面临新的挑战：其一，单一配体如抗体和靶蛋白之间僵硬的一比一结合作用容易造成信号的衰减，影响新型信号放大策略的进一步引入；其二，利用两种不同配体分别识别靶蛋白上不同结构域而设计的“三明治”检测体系普适性较差，应用范围比较局限，因为并非所有靶蛋白均可以具备满意的“三明治”结合位点。基于现有的蛋白质分析检测技术普遍存在静态、低效、低时空分辨等缺点，难以满足生命科学研究及临床医学检验的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新颖的不依赖于抗体、对STAT3蛋白活化水平进行检测和分析的电化学方法。本方法的目的是通过下列技术措施实现的：选用可以与STAT3特异性结合的“诱饵寡核苷酸序列”(decoyoligonucleotide,DecoyON)取代传统的抗体，与一条互补DNA序列一起作为识别捕获靶标STAT3蛋白的DNA探针自组装于电极表面，所述的DNA探针与活化后的STAT3蛋白结合；通过DNA工具酶切除未与STAT3蛋白结合的DNA探针，再选用特殊磷酸化肽Ac-(pY)LPQTV-NH2结合靶标蛋白STAT3释放DNA探针，之后加入Zr4+以及磷酸化纳米石墨烯复合信标，通过Zr4+与磷酸基团间稳定的配位交联作用将磷酸化纳米石墨烯复合信标与释放DNA探针相连接，标记在电极表面，最后利用纳米石墨烯装载的大量磷酸基团配位大量三价铁离子催化邻苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)氧化产生大量电化学活性分子2,3-二氨基吩嗪(2,3-diaminophenazine,DAP)，实现电极表面信号的多重放大。所述的诱饵寡核苷酸序列修饰于电极上，其序列的5’端均修饰有巯基基团，与它们相互补的DNA序列的5’端有磷酸基团修饰。序列如下：捕获探针STAT3DecoyON：5’-SH-Spacer18-CATTTCCCGTAAATC-3’，和它的互补序列：5’-HPO4-GATTTACGGGAAATG-3’，该DNA探针是一段与STAT3靶基因启动子顺式作用元件序列相一致，又比后者具有更卓越亲和力的双链短核苷酸，可以和STAT3蛋白活化二聚体特异性结合。所述的DNA探针自组装于电极表面的方法为诱饵寡核苷酸序列在10mM三氯乙基磷酸酯溶液中室温孵育1小时，以去除探针DNA分子间或分子内的二硫键，将诱饵寡核苷酸序列及其互补DNA序列在95℃水浴锅中加热5分钟，后缓慢退火降至室温，将金电极浸入到含0.2μM退火所得双链DNA的DNA固定缓冲液中，再通过Au-S键的共价作用，使DNA探针自组装在金电极表面形成一个致密的单分子层；所述的DNA固定缓冲液配方为10mMTris-HCl，1mMEDTA，0.1MNaCl，10mMTCEP，0.2μM退火所得双链DNA，pH7.4。将金电极浸入到活化后的STAT3蛋白溶液中温育，电极上DNA探针可以捕获结合活化的STAT3二聚体，STAT3蛋白和电极上的DNA捕获探针间的温育时间不少于120分钟。所述的DNA工具酶即DNaseⅠ内切酶，对双链DNA具有切割活性，将没有结合有STAT3蛋白活化二聚体的、仍然裸露于电极上的过量DNA探针全部从电极界面上切除。DNaseⅠ酶切反应时间定为不少于30分钟。所述的磷酸化肽Ac-(pY)LPQTV-NH2，结合靶标蛋白STAT3释放DNA探针，即磷酸化肽Ac-(pY)LPQTV-NH2与STAT3蛋白的SH2活化区特异性结合，使有活性的STAT3二聚体构象发生改变，重新解聚成为无活性的无法与DNA探针结合的单体，已被捕获的STAT3蛋白从电极上洗脱下来，原本与STAT3蛋白质结合的DNA探针得以完全暴露于电极上，使靶标蛋白的浓度转换成为DNA探针量的多少。磷酸化肽对STAT3和DNA探针间结合的有效逆转和抑制(IC50＝150nM)，将金电极浸入到多肽反应溶液中(1μMAc-(pY)LPQTV-NH2，10mMTCEP，10mMTBS，pH7.4)，冲洗电极时加入含有0.5％Tween-20的Tris-HCl缓冲液防止STAT3解离后在电极表面的非特异性吸附。捕获有靶标蛋白的电极与特殊磷肽孵育时间不少于60分钟。所述的磷酸化纳米石墨烯复合信标由修饰有磷酸基团的1-芘甲胺盐酸盐(1-Pyrenemethylamine-Tyr(P)-OH,1mM)(购自上海科肽生物有限公司)与氧化石墨烯混匀制备而成。制备方法如下：石墨烯使用离心纯化的方式进行处理。首先将石墨烯溶解到双蒸水中并超声60min。随后离心去除较大片层。之后，取上清，通过离心洗涤的方式(16,000rcf,20min)进一步纯化三次。最后，获得的沉淀在80℃的烘箱中烘干，获得鳞片状的氧化石墨烯。氧化石墨烯(0.5mg/mL)在每次实验前需置于冰水中超声5分钟，得到褐色均一溶液。此后，将修饰有磷酸基团的1-芘甲胺盐酸盐(1-Pyrenemethylamine-Tyr(P)-OH,1mM)与氧化石墨烯混匀。室温下搅拌30min后，离心分离以除去未吸附以及吸附不牢的1-芘甲胺盐酸盐，由此制得磷酸化纳米石墨烯复合信标。所述的Zr4+与磷酸基团间稳定的配位交联作用，指Zr4+一方面通过配位作用与电极上残留的DNA末端修饰的磷酸基团发生交联，另一方面Zr4+与纳米石墨烯复合信标中修饰的磷酸基团反应，发挥“离子胶水”的作用将磷酸化纳米石墨烯复合信标连接至电极表面。STAT3洗脱后的电极与磷酸化纳米石墨烯复合信标温育时间不少于60分钟。Zr4+仅识别和交联少量的磷酸基团，剩余的大量磷酸基团可以和三价铁离子通过配位作用相螯合，借助大量形成的络离子发挥其对H2O2的催化活性。所述的纳米石墨烯复合信标配位大量三价铁离子催化OPD氧化产生大量DAP的方法中，将已标记有磷酸化纳米石墨烯复合信标的金电极置于FeCl3反应溶液中(50μMFeCl3,100mMHCl,pH7.0)，在室温下静置1小时。用100mMHCl溶液和双蒸水依次冲洗电极，以终止反应并去除非特异性吸附。在加入H2O2前提下，再将电极浸入到1mL的Tris-HCl反应溶液中(20mM,pH7.5)在50℃水浴条件下孵育30分钟，该1mL的Tris-HCl反应溶液中含有1μL的HCl和过量的2.5mgOPD。所述的电极信表面信号放大的方法，即室温下通过电化学工作站本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种不依赖于抗体、对STAT3蛋白活化水平进行检测的电化学方法，其特征在于选用与STAT3蛋白特异性结合的“诱饵寡核苷酸序列”取代传统的抗体，与一条互补DNA序列一起作为识别捕获靶标STAT3蛋白的DNA探针自组装于电极表面，所述的DNA探针与活化后的STAT3蛋白结合；通过DNA工具酶切除未与STAT3蛋白结合的DNA探针，选用特殊磷酸化肽Ac‑(pY)LPQTV‑NH2结合靶标蛋白STAT3释放DNA探针后，加入Zr

【技术特征摘要】
1.一种不依赖于抗体、对STAT3蛋白活化水平进行检测的电化学方法，其特征在于选用与STAT3蛋白特异性结合的“诱饵寡核苷酸序列”取代传统的抗体，与一条互补DNA序列一起作为识别捕获靶标STAT3蛋白的DNA探针自组装于电极表面，所述的DNA探针与活化后的STAT3蛋白结合；通过DNA工具酶切除未与STAT3蛋白结合的DNA探针，选用特殊磷酸化肽Ac-(pY)LPQTV-NH2结合靶标蛋白STAT3释放DNA探针后，加入Zr4+以及磷酸化纳米石墨烯复合信标，通过Zr4+与磷酸基团间稳定的配位交联作用将磷酸化纳米石墨烯复合信标与释放的DNA探针相连接标记在电极表面，最后利用纳米石墨烯装载的大量磷酸基团配位大量三价铁离子催化邻苯二胺氧化产生电化学活性分子2,3-二氨基吩嗪，使电极表面信号被放大，通过电化学方法检测被放大的电极表面信号，从而实现对STAT3蛋白活化水平的检测。2.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于“诱饵寡核苷酸序列”的5’端修饰有巯基基团，序列为5’-SH-Spacer18-CATTTCCCGTAAATC-3’；所述的互补DNA序列的5’端有磷酸基团修饰，序列为5’-HPO4-GATTTACGGGAAATG-3’。3.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于所述的DNA探针自组装于电极表面的方法为诱饵寡核苷酸序列在10mM三氯乙基磷酸酯溶液中室温孵育1小时，以去除探针DNA分子间或分子内的二硫键，将诱饵寡核苷酸序列及其互补DNA序列在95℃水浴锅中加热5分钟，后缓慢退火降至室温，将金电极浸入到含0.2μM退火所得双链DNA的DNA固定缓冲液中，再通过Au-S键的共价作用，使DNA探针自组装在金电极表面形成一个致密的单分子层；所述的DNA固定缓冲液配方为10mMTris-HCl，1mMEDTA，0.1MNaCl，10mMTCEP，0.2μM退火所得双链DNA，pH7.4。4.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于电极表面的DNA探针与活化后的STAT3蛋白温育时间不少于2小时，电极上DNA探针捕获结合活化的STAT3二聚体实现DNA探针与活化后的STAT3蛋白的结合。5.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于所述的DNA工具酶选用...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙丽洲，殷婷婷，黄欢，
申请(专利权)人：孙丽洲，
类型：发明
国别省市：江苏,32