一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim-3抗体和α-galcer的组合及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim‑3抗体和α‑galcer的组合及应用。本发明专利技术研究团队发现，HBV感染患者CD8+T、NK、iNKT和单核巨噬细胞表面Tim‑3均呈现不同程度升高，Tim‑3高表达与HBV患者肝固有免疫、适应性免疫耐受密切相关，除α‑Galcer外，Tim‑3在阻碍HBV清除过程中发挥关键作用，在α‑Galcer活化iNKT的同时，干预免疫细胞检查点Tim‑3，能逆转HBV肝免疫耐受，实现HBV转归。本发明专利技术采用抗Tim‑3抗体联合应用α‑Galcer可有效清除HBV，显著降低HBV病毒载量及血清HBsAg及肝组织pgRNA水平。

【技术实现步骤摘要】
一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim-3抗体和α-galcer的组合及应用
本专利技术涉及乙型肝炎生物治疗研究领域，尤其涉及一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim-3抗体和α-galcer的组合以及α-galcer联合抗Tim-3抗体免疫疗法在清除乙型肝炎病毒中的作用。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)为嗜肝DNA病毒，HBV感染可诱发肝脏炎症反应，造成肝细胞损伤。HBV持续感染可诱发肝纤维化，甚至肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)，是危害人类身体健康的重要危险因素。HBV慢性感染与HBV诱导机体发生肝免疫耐受有关。慢性感染患者的肝固有免疫细胞，肝适应性免疫细胞均处在对HBV低应答、甚至无应答状态，这使HBV产生免疫逃逸并在肝细胞内持续扩增。现有HBV临床治疗方案多倾向于药物抗病毒疗法，但药物治疗只能抑制病毒复制，并不能彻底清除肝细胞内HBV，且长时间药物治疗易对机体产生一定毒副作用并导致HBV耐药株的出现。而通过干预免疫检查点并结合其他免疫调节增强剂的联合治疗将有助于逆转肝免疫耐受、恢复机体自身免疫细胞功能、增强免疫细胞活性，在阻断HBV慢性感染中展现了良好的应用前景。慢性HBV感染的形成机制非常复杂，关于细胞免疫的调控机制原理也一直是学者们的研究热点。iNKT(invariantnaturekillerT)细胞，又称经典型或恒定NKT细胞，同时表达NK细胞表面标志以及恒定的Vαl4-Jα18链TCR。iNKT细胞，识别由CD1d提呈的脂类抗原分子，可被α-半乳糖酰基鞘氨醇(α-GalCer)特异性激活。被活化的iNKT细胞产生多种细胞因子，尤其是IL-4和IFN-γ，参与多种途径的免疫调节。iNKT细胞可以被CD1d-β2m复合物(第一信号)激活，第二信号既可通过CD28、ICOS等通路传递正向活化信号，也可通过CTLA-4、PD-1、Tim-3等通路传递负向抑制信号。作为联系机体固有免疫、适应性免疫的桥梁，iNKT(InvariantnaturalkillerT)细胞在肝免疫过程中发挥重要作用。活化iNKT细胞可增强肝固有免疫、适应性免疫应答。α-Galcer可有效活化iNKT细胞，但临床研究证实，常用α-Galcer治疗剂量可有效活化iNKT细胞并降低HBVDNA病毒载量，但毒性作用太大。而降低α-Galcer剂量虽可降低度副作用，但活化iNKT和抑制HBV复制的作用却大大降低，治疗效果很不理想。Tim-3(Tcellimmunoglobulin-andmucin-domain-containingmolecule-3)是关键的免疫负调控分子，与其配体galectin-9相互作用可负向调控IFN-γ的产生，在诱导机体免疫耐受中发挥重要作用。Tim-3最初发现其主要表达于Th1细胞中，但最近研究显示Tim-3在CD8+T、DC、NK、NKT和单核巨噬细胞等多种免疫细胞上均有表达，并通过影响这些细胞的功能，参与多种疾病的发生发展。靶向Tim-3的免疫疗法已在多种肿瘤中展现了很好的治疗作用，但目前靶向Tim-3对于逆转HBV慢性感染的作用和机制尚不清楚。
技术实现思路
基于现有HBV清除方法的缺乏与不足，本专利技术阐明抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer清除HBV的可行性，为HBV转归临床治疗提供理论依据和治疗方案。具体的，本专利技术公开了以下技术方案：首先，本专利技术通过实验证实，HBV感染患者CD8+T、NK、iNKT和单核巨噬细胞表面Tim-3表达均呈现不同程度升高，Tim-3高表达与HBV患者肝固有免疫、适应性免疫耐受密切相关。基于这一发现，本专利技术提供一种iNKT细胞表面Tim-3表达水平检测的诊断试剂，所述诊断试剂用于检测iNKT细胞表面Tim-3的表达水平。在具体实施方案中，所述诊断试剂用于检测iNKT细胞表面Tim-3的蛋白表达水平，例如可以借助流式细胞仪检测iNKT细胞表面Tim-3蛋白表达水平。更为优选的实施方案中，所述诊断试剂包含抗Tim-3的抗体，例如WO2016161270A1公开了一系列抗Tim-3的抗体，在此一并纳入本专利技术。其次，本专利技术发现除α-Galcer外，某些免疫检查点负性调控因素(Tim-3)在阻碍HBV清除过程中发挥关键作用，在α-Galcer活化iNKT的同时，干预免疫细胞检查点Tim-3，有可能逆转HBV肝免疫耐受，实现HBV转归，并且通过进一步的实验结果确认，抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer可有效清除HBV，显著降低HBV病毒载量及HBsAg及肝组织pgRNA水平。本专利技术涉及的联合生物治疗方案，将为HBV联合治疗提供理论依据。基于这一发现，本专利技术提供一种用于HBV慢性感染治疗的药物组合物，该组合物包括抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物。抗Tim-3抗体包括但不限于现有技术公开的针对Tim-3的抗体，例如WO2016161270A1公开了一系列抗Tim-3的抗体，在此一并引入本专利技术。α-半乳糖酰基鞘氨醇(α-Galcer)是一种从海绵体中提取有CD1d递呈的糖酯，由亲水性的碳酸化合物部分与疏水性的酰基鞘氨醇部分通过α连接形成，α-Galcer是NKT细胞的配体，在体内外均能有效激活NKT细胞。α-Galcer功能衍生物，是指α-Galcer的衍生物或其改性糖酯，其作用机制同α-Galcer，能有效激活NKT细胞。例如CN105339379A公开了改性的糖酯及其制备方法，在此一并纳入本专利技术。优选的实施方案中，抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物的质量比为(30-80)：1，例如，50:1。所述抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物的用量比可相应调剂，使其既可以发挥阻断Tim-3的作用又可以发挥α-Galcer效果、有效激活NKT细胞，从而显著降低HBV病毒载量及HBsAg及肝组织pgRNA水平。本专利技术所述的药物组合物除包括抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物外，还可以包括常规药学上可接受的载体或赋形剂等，以满足制剂过程中的需要。此外，本专利技术还公开了抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物在制备HBV慢性感染治疗的药物中的用途。具体的实施方案中，所述药物(抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物)可有效清除HBV、显著降低HBV病毒载量、降低HBsAg量、降低肝组织pgRNA水平。为增强肝免疫细胞功能，强化其清除HBV病毒作用，本专利技术重点从以下几个方面进行研究并取得了相应有益效果：(1)本专利技术通过实验确认了Tim-3在HBV感染肝iNKT细胞高表达的结果；通过检测iNKT细胞表面Tim-3的表达水平可以辅助用于HBV慢性感染的诊断。(2)本专利技术研究发现体内注射抗Tim-3抗体，对iNKT细胞具有活化作用，并且活化的iNKT细胞通过分泌细胞因子增强NK、CD8+T细胞功能；为HBV联合治疗提供理论依据。(3)本专利技术通过实验证实抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer可有效清除HBV，显著降低HBV病毒载量及HBsAg及肝组织pgRNA水平，克服了单纯应用α-Galcer活化iNKT细胞不能有效降低HBVDNA病毒载量的问题。附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
iNKT细胞表面Tim‑3在制备HBV慢性感染的诊断试剂中的应用，所述诊断试剂用于检测iNKT细胞表面Tim‑3的表达水平。

【技术特征摘要】
1.iNKT细胞表面Tim-3在制备HBV慢性感染的诊断试剂中的应用，所述诊断试剂用于检测iNKT细胞表面Tim-3的表达水平。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂用于检测iNKT细胞表面Tim-3的蛋白表达水平。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂包含抗Tim-3的抗体。4.一种用于HBV慢性感染治疗的药物组合物，该组合物包括抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物。5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物的质量比为(30-80)：1，优选的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马春红，许勇，杜宪红，武专昌，梁晓红，高立芬，王泽华，谭思雨，王体潇，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37