一种组织光透明剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种组织光透明剂，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：15‑25％，甲酰胺：8‑15％，曲拉通：10‑20％，N,N,N',N'‑四(2‑羟基丙基)乙二胺：20‑25％，余量为水。该组织光透明剂能短时间有效降低生物组织散射，实现组织透明化，还能很好地保持生物组织的完整性，维持体积基本不变，不发生膨胀或收缩，组织不会变得易脆，使成像深度和信噪比得到极大提高，且内源荧光信号强度基本不受影响。本发明专利技术还提供了该组织光透明剂的制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种组织光透明剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医学和透明样本制备
，具体涉及一种组织光透明剂及其制备方法和应用。
技术介绍
随着光学成像技术的不断发展，高分辨获取生物组织的结构功能信息已成为可能，但生物组织的不透明性制约了光学成像技术在生物医学领域中的应用。近年来兴起的组织光透明技术使得器官不必切片，就可在完整状态下进行观察研究，该技术的核心是向生物组织中引入高渗、高折射的化学试剂能够有效降低生物组织的散射特性，使样品变透明，极大地提高成像的深度。现有技术中采用的组织透明技术包括BABB技术、Scale技术、SeeDB技术、CLARITY技术等，其中BABB技术采用有机溶剂，处理后组织透明效果虽好，当组织却严重皱缩，且导致组织中荧光标记信号猝灭；Scale技术是将生物组织持续浸泡在尿素溶液中，该方法使组织透明需要的时间较长，还会引起组织严重膨胀；SeeDB技术采用浓度不断增加的果糖溶液浸泡组织，组织形态虽保持良好，但组织却常变为棕色，而且果糖溶液粘稠，操作不便；CLARITY技术利用电泳去除组织中引起散射的脂类物质得以实现透明，该方法的组织透明效果很好，但需先采用特殊的水凝胶预先固定组织，且溶脂会造成细胞膜破坏、组织天然纹理消失。以上报道的组织光透明方案或多或少都会改变样品的形态，破坏组织的天然纹理结构，使光学信号受到破坏，影响成像结果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种组织光透明剂，它能短时间有效降低生物组织散射，实现组织透明化，还能很好地保持生物组织的完整性，维持体积基本不变，使成像深度和信噪比得到极大提高，且内源荧光信号强度基本不受影响。第一方面，本专利技术提供了一种组织光透明剂，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：15-25％，甲酰胺：8-15％，曲拉通：10-20％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：20-25％，余量为水。本专利技术中提供的所述组织光透明剂的配方合理高效，其中，尿素具有水化作用，可进入生物组织中紧密折叠区域的折射率高的蛋白质，产生渗透梯度以允许水份进入，但容易引起组织膨胀，但甲酰胺的加入，能很好地减少组织膨胀；曲拉通可起到透化作用，使得溶液能够进入组织及细胞间隙；N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺能在有效占据生物组织表面的水结合位点的同时稳定了空间结构，在以上4种主要成分的协同作用下，能够使得生物组织的各组成成分(胶原纤维、细胞膜、细胞器等与组织间液)的折射率相匹配，在快速有效地降低生物组织散射，使组织变得透明的同时，还能较好地控制生物组织体积基本不变，避免发生膨胀或收缩，组织不会变得易脆，能最大限度地维持生物组织的空间结构，使得成像深度和质量得到极大提高，且使内源性光学强度不受影响。所述组织光透明剂适用于大脑、眼球、肌肉等富含胶原纤维的生物组织的透明化，对生物组织深层结构成像以重建3D组织结构，研究其结构功能具有重要意义。优选地，所述组织光透明剂中，曲拉通的质量分数为15-20％。优选地，所述组织光透明剂中，甲酰胺的质量分数为8-12％。进一步可选为8-10％。进一步地，所述组织光透明剂中，所述尿素与甲酰胺的质量比为(1.2-2.5)：1。优选为(1.3-2.0)：1。本专利技术的一实施例中，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：25％，甲酰胺：10％，曲拉通：20％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：10％，余量为水。本专利技术的另一实施例中，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：20％，甲酰胺：15％，曲拉通：10％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：20％，余量为水。本专利技术的另一实施例中，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：15％，甲酰胺：8％，曲拉通：15％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：20％，余量为水。本专利技术的另一实施例中，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：25％，甲酰胺：12％，曲拉通：20％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：15％，余量为水。第二方面，本专利技术提供了一种组织光透明剂的制备方法，包括以下步骤：将尿素、甲酰胺、曲拉通、N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺与水混合，并于35-47℃下加热溶解，直至溶液澄清透明，即得到所述组织光透明剂，其中，所述组织光透明剂中各组分的质量分数为：尿素：15-25％，甲酰胺：8-15％，曲拉通：10-20％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：20-25％，余量为水。在制备所述组织光透明剂的过程中，加热溶解的温度不能过高，以免尿素和甲酰胺分解。优选地，所述加热溶解的温度为35-40℃。本专利技术实施例中，组织光透明剂的各组分可以先一起加入到水中，再加热溶解；也可以将粉末的尿素加入水中加热溶解后，再按比例加入其他溶液成分，混匀即可。本专利技术第二方面提供的所述组织光透明剂的制备方法简单，成本低廉。第三方面，本专利技术提供了一种如第一方面所述的组织光透明剂或第二方面所述的组织光透明剂的制备方法在组织透明化处理和/或组织成像中的应用。其中，所述组织为离体生物组织。所述组织可以是大脑、眼球、肌肉等富含胶原纤维的生物组织。经上述组织光透明剂处理后的透明生物组织，可以用于各种光学显微镜的生物成像，如宽场荧光显微镜、激光片层扫描显微镜、激光共聚焦显微镜、双光子显微镜、基于双光子激发荧光和二次谐波的多光子显微镜等。本专利技术一实施方式中，提供了一种使组织透明的方法，包括以下步骤：(1)将生物组织进行固定和分离；(2)将上述所得生物组织浸泡在本专利技术第一方面所述的组织光透明剂中，直至生物组织变得透明。本专利技术的一实施例中，在将生物样品经灌注处理、清除血液后，在低温下采用质量分数为4％的多聚甲醛里固定8-12小时后，取出用磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗后，得到固定好的生物样品，以便接着在组织光透明剂中浸泡。具体地，所述步骤(1)是采用心脏灌注的方法进行：腹腔麻醉后，打开胸腔，经心夹出将输液器针头穿入左心室，灌注生理盐水或PBS，迅速剪开右心耳，冲洗体循环血液，待血液冲洗完成后再灌注质量分数为4％的多聚甲醛溶液进行固定8-12小时。优选地，所述组织为脑组织、皮肤、眼球、肌肉、胚胎、肾脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肠道组织、卵巢组织等。本申请中，可根据不同生物组织的来源、年龄、体重等，在适当的范围内调节所用组织光透明剂内的各组分的比例以及浸泡的时间。例如，对于胚胎期或刚出生的小鼠，其脑组织的脂质成分居多，且水分含量很大，可适当调低尿素和甲酰胺比例，时间控制在2-3天即可达到透明效果，且形态大小基本保持不变。此时，适用于胚胎期或刚出生的小鼠的全脑组织的透明剂的配方为：尿素：15％，甲酰胺：8％，曲拉通：15％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：20％，余量为水。再例如，该组织透明试剂对肾脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肠道组织等完整组织进行浸泡4-5天就能达到很好的透明效果。特别地，当所述生物组织为肾脏、肝脏、脾脏时，相对于肺组织，其透明化处理较难，优选地，将生物组织置于上述组织透明试剂中后，并置于35-47℃的水浴锅中进行透明处理，这样可以提高透明化速度和透明效果。本专利技术一实施方式中，当所述组织为生物组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组织光透明剂，其特征在于，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：15‑25％，甲酰胺：8‑15％，曲拉通：10‑20％，N,N,N',N'‑四(2‑羟基丙基)乙二胺：20‑25％，余量为水。

【技术特征摘要】
1.一种组织光透明剂，其特征在于，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：15-25％，甲酰胺：8-15％，曲拉通：10-20％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：20-25％，余量为水。2.如权利要求1所述的组织光透明剂，其特征在于，所述组织光透明剂所中，甲酰胺的质量分数为8-12％。3.如权利要求1所述的组织光透明剂，其特征在于，所述尿素与甲酰胺的质量比为(1.2-2.5)：1。4.如权利要求1所述的组织光透明剂，其特征在于，所述组织光透明剂包括以下质量分数的各组分：尿素：25％，甲酰胺：10％，曲拉通：20％，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺：10％，余量为水。5.一种组织光透明剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将尿素、甲酰胺、曲拉通、N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺与水混合，并于35-47℃下加热溶解，直至溶液澄清透明，即得到所述组织光透明剂，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑炜，夏先园，张洋，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44