本发明专利技术提供：对以高水平表达于癌症细胞的具有糖链结构的MUC4具有特异性的抗体；构成适于产生该抗体的抗原的糖肽；和通过上述抗体诊断、预防和/或治疗癌症的新手段和方法。本发明专利技术涉及针对糖肽的单克隆抗体。所述糖肽包含具有SEQ ID NO:1给出的氨基酸序列的人MUC4的串联单元肽和O‑连接糖链。所述O‑连接糖链是N‑乙酰半乳糖胺(GalNAc)并且与所述串联单元肽中第八个氨基酸苏氨酸连接。本发明专利技术还包括：用于产生针对人MUC4的单克隆抗体的糖肽；用于检测人体液样品中MUC4的方法；包括上述单克隆抗体的试剂盒；和含有上述单克隆抗体作为活性组分的用于预防和/或治疗恶性肿瘤的药物组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对粘蛋白4(MUC4)糖肽的抗体及其用途
本专利技术涉及抗体领域中的技术。更具体地，本专利技术涉及针对粘蛋白4(MUC4)糖肽的抗体以及采用该抗体的诊断技术和用于预防和/或治疗恶性肿瘤的技术。相关申请的交叉引用该申请要求2014年2月6日提交的日本专利申请号2014-20869的优先权，其整体通过引用并入本文。
技术介绍
粘蛋白(Mucin)是覆盖气管、消化道如胃、管腔如性腺等的粘液的重要糖蛋白。粘蛋白具有无数的通过O-糖苷键与多肽(核心蛋白)键接的糖链。粘蛋白的核心蛋白由多种粘蛋白基因(MUC基因)编码。粘蛋白的重要作用是保护并水化以及润滑粘膜。粘蛋白还参与调节上皮的分化和再生、细胞粘附、免疫应答、细胞信号传导等。近年，已经克隆了编码许多粘蛋白核心蛋白的多个基因，且它们的完整或部分序列已经被测定。大部分粘蛋白具有许多重复序列结构域(串联重复)。这些串联重复包含不同长度的氨基酸序列(串联单元)，且富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基。不同结构的许多O-连接糖链被添加至这些丝氨酸或苏氨酸残基。在完整的粘蛋白中，不被认为是经O-糖基化的残基(裸肽)以恒定的比例存在。一般而言，糖链包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、唾液酸(SA)、甘露糖(Man)等等。粘蛋白具有的形式有分泌的粘蛋白，其由上皮细胞等产生，以及膜结合的粘蛋白，其具有疏水跨膜位点且以和细胞膜结合的状态存在。粘蛋白的核心蛋白统称为粘蛋白，编号以发现顺序分配。在人中，已经报道编码这些核心蛋白的19个基因(MUC1、2、3A、3B、4、5AC、56、6、7、8、9、11、12、13、15、16、17、18、19)。其中，11个是跨膜粘蛋白而7个是分泌型粘蛋白(非专利文献1)。MUC4存在于气管、结肠、胃、外宫颈、肺等的上皮组织(非专利文献1)。MUC4已知与多种疾病例如癌症相关。人MUC4的胞外结构域含有不同数目的16个氨基酸残基的串联单元，所述串联单元具有七个潜在的O-糖基化位点。在O-糖苷中，糖最初通过O-键接被转移至丝氨酸和苏氨酸残基，最大量是GalNAc，其次是Man、Fuc、GlcNAc等。癌症细胞不完全加工O-糖苷，并引起常见癌症糖抗原Tn(GalNAcα-1-Ser/Thr)、STn(NeuAcα2-6GalNAcαl-O-Ser/Thr)和(Galβ1-3GalNAcα-1-O-Ser/Thr)的表达。在初始的糖之后，糖被一个接一个地转移且O-糖苷糖链长得更长。GalNAc最初被转移至的O-糖苷的许多核心结构是已知的且已经被编号。当前已知的主要核心结构标明如下。更多复杂结构的更长糖链基于这些结构生长。Core0(Tn抗原)GalNAcCore1(T抗原)Galβ1-3GalNAcCore2:Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAcCore3:GlcNAcβ1-3GalNAcCore4:GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAcCore5:GalNAcαl-3GalNAcCore6:GlcNAcβ1-6GalNAcCore7:GalNAcαl-6GalNAcCore8:Galα1-3GalNAcCore9:Galβ1-3(Galβ1-6)GalNAcCore10:GalNAcβ1-3GalNAcCore11:GalNAcβ1-3(GalNAcβ1-6)GalNAcCore12:Galβ1-3(Glcβ1-6)GalNAcCore13:Galpl-3(Glcβ1-4)(Glcβ1-6)GalNAc粘蛋白核心蛋白通过O-糖基化的糖链的添加在外层上皮细胞的保护、免疫反应、细胞粘附、炎性反应、癌症发生和癌转移起重要作用。在粘蛋白中，已经进行了许多对MUC1粘蛋白的研究。已经报道了MUC1在癌症发生中的过表达以及O-糖基化的剧烈变化和癌症发生和转移之间的联系。此外，采用MUC1单克隆抗体的肺癌和卵巢癌诊断和治疗性药物的研发正在进行(非专利文献2、专利文件1和2)。已经报道MUC4核心蛋白表达的显著涨落伴随癌症发生(非专利文献1)。已经发现MUC4在胰腺癌和食道癌的过表达加速癌症增殖和转移(非专利文献1)。另外，通过抑制MUC4基因在癌症细胞中的表达，癌症细胞的增殖被显著抑制，并且体内研究已经清楚细胞迁移、细胞粘附和聚集加速。已经表明如果可能抑制MUC4的功能，将可能阻止转移性癌症的进展和转移(非专利文献3)。此外，最近已经发现MUC4和半乳凝素之间的相互作用在胰腺癌等的转移中是重要的(非专利文献4和5)。专利文献1：W02010/050528专利文献2：W02011/135869专利文献3：JP-A-2006-111618专利文献4：W02011/054359非专利文献1：Chaturvedietal.,FASEBJ.22:966-981(2008)非专利文献2：Beatsonetal.,lmmunotherapy2:305-327(2010)非专利文献3：Singhetal.,CancerRes.64:622-630(2004)非专利文献4：LiuandRabinovich,NatureRev.Cancer5:29-41(2005)非专利文献5：Sanapatietal.,ClinCancerRes17:267-274(2011)非专利文献6：Moniauxetal.,J.Histochem.Cytochem.52:253-261(2004)非专利文献7：Zhangetal.,J.CellularPhysiol.204:166-177(2005)非专利文献8：Matsushitaetal.,Biochemistry52:402-414(2013)非专利文献9：Hashimotoetal.,Chem.Eur.J.17:2393-2404(2011)非专利文献10：Ohyabuetal.,J.Am.Chem.Soc.131:17102-17109(2009)非专利文献11：Matsusitaetal.,Biochim.Biophy.Acta1840:1105-1116(2014)非专利文献12：Sanapatietal.,ClinCancerRes17:267-274(2011)过去已经制备了许多针对未指明结构的纯化的MUC4以及MUC4基因的重组和合成肽的单克隆抗体。例如，已经获得了针对MUC4β单元肽的单克隆抗体8G7(非专利文献6)和针对MUC4串联单元肽STGDTTPLPVTDTSSV的单克隆抗体1G8(非专利文献7)并应用为研究工具。有报道针对衍生自MUC4的糖肽的单克隆抗体4D9、3C9、6E3、和6C11(专利文献4)。然而，它们全部都是低特异性抗体，其中MUC4肽的糖修饰位点和数目不是特定的。因此，本专利技术的目的是提供具有在癌症细胞中高度表达的糖链结构的MUC4的特异性抗体，用作适于制备该抗体的抗原的糖肽，以及基于该抗体的诊断、预防和/或治疗癌症的新手段和方法。本专利技术人通过NMR证明在结合至所述抗体的表位区域中的侧链的糖链的主链肽中发生结构特异性构象改变，肽构象对特定氨基酸残基的糖链修饰敏感变化，并且这明确了MUC1抗体中的抗原结构(非本文档来自技高网...
【技术保护点】
针对糖肽的单克隆抗体，其中所述糖肽包含具有SEQ ID NO:1给出的氨基酸序列的人MUC4的串联单元肽和O‑连接糖链；所述O‑连接糖链是N‑乙酰半乳糖胺(GalNAc)并且与所述串联单元肽中第八个氨基酸苏氨酸连接。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.06 JP 2014-0208691.针对糖肽的单克隆抗体，其中所述糖肽包含具有SEQIDNO:1给出的氨基酸序列的人MUC4的串联单元肽和O-连接糖链；所述O-连接糖链是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)并且与所述串联单元肽中第八个氨基酸苏氨酸连接。2.具有如下i)至iii)所述结合特性的单克隆抗体：i)强烈地结合衍生自用作抗原的MUC4的糖肽Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser，其中Tn表示N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)构成的O-连接糖链；ii)不结合具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽，且不结合具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的糖肽，所述糖肽中Tn修饰位于不同于用作抗原的糖肽的位置；iii)不结合或者弱结合其中Tn修饰在MUC1、MUC2或MUC16的串联单元肽的糖肽。3.权利要求1或2的单克隆抗体，其由以登录号NITEBP-01777注册的杂交瘤细胞系统分泌，名称为单克隆抗体SN-04。4.具有如下i)至iv)所述结合特性的单克隆抗体：i)强烈地结合衍生自用作抗原的MUC4的糖肽Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser，其中Tn表示N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)构成的O-连接糖链；ii)不结合具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽，且不结合具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的糖肽，所述糖肽中Tn修饰位于不同于用作抗原的糖肽的位置；iii)强烈地结合其中Tn修饰在MUC2和MUC16的串联单元肽的糖肽；和iv)不结合其中Tn修饰在MUC1的串联单元肽的糖肽。5.权利要求1或4的单克隆抗体，其由以登录号NITEBP-01774注册的杂交瘤细胞系统分泌，名称为单克隆抗体SN-01。6.权利要求1或4的单克隆抗体，其由以登录号NITEBP-01775注册的杂交瘤细胞系统分泌，名称为单克隆抗体SN-02。7.具有如下i)至iii)所述结合特性的单克隆抗体：i)强烈地结合衍生自用作抗原的MUC4的糖肽Ser-Ala-Se...
【专利技术属性】
技术研发人员：西村绅一郎，三好利尚，成地健太郎，田中诚一，
申请(专利权)人：医化学创药株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP
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