适用于异种移植的三重转基因猪制造技术

本申请提供了改善排斥相关症状、减轻过早分离的方法，并且提供了产生具有改变的表位谱的目的化合物的方法。提供了具有破坏的基因的敲除猪以及从其来源的猪器官、组织和细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】适用于异种移植的三重转基因猪相关申请的交叉引用本申请要求2014年10月22日提交的美国临时申请No：62/067,129的优先权，其内容通过引用并入本文。序列表的并入与本文一同提交的文本格式的序列表出于所有目的通过引用整体并入本文。关于联邦资助的研究或开发的声明不适用。
本专利技术一般地涉及用于开发适于移植到人中的转基因猪、转基因猪器官、组织或细胞(特别是具有降低的引起血小板减少症倾向、超急性排斥(hyperacuterejection，HAR)反应或血小板摄取的转基因猪)的异种移植和遗传修饰的领域。
技术介绍
众所周知，从一个动物到同一物种的另一个动物(例如人到人)的移植是许多严重病症(包括肾、心、肺、肝和其他器官疾病和皮肤损伤(例如严重烧伤疾病))的常规治疗选择。然而，众所周知，没有足够的合适器官可用于移植以满足当前或预期的器官移植的临床需求。肾移植名单上约有100,000名患者，他们接受移植或死亡之前在等待名单上平均保留将近5年。在肾衰竭的患者中，透析提高了患者可等待移植的时间长度。在UNOS肝移植的全国等待名单上有超过18,000名患者，然而在美国每年进行不超过7000次移植。对于患有肝病或肝衰竭的患者，没有相当于透析的系统。异种移植(将器官、组织或细胞从一种动物移植到不同物种的另一种动物中(例如将猪器官移植到人接受者中))具有减轻可用于移植之器官短缺的潜力，这潜在地帮助全球数千人。然而，使用标准的未修饰的猪组织到人或其他灵长类动物中的异种移植伴随着严重的移植组织排斥。排斥可以是超急性排斥、急性排斥、慢性排斥，可涉及存活限制性的血小板减少性凝血病(survivallimitingthrombocytopeniacoagulopathy)或者可以是急性体液异种移植反应(acutehumoralxenograftreaction，AHXR)。对移植组织上存在的猪抗体的人超急性排斥反应如此强烈，使得移植组织通常在移植到人体中的数分钟或数小时内被人免疫系统损伤。此外，不同的排斥机制可以以器官偏好的方式占主导地位。参见Demetris等，1998“Antibody-mediatedRejectionofHumanOrthotopicLiverAllografts.AstudyoflivertransplantationacrossABObloodgroupbarriers”，AmJ.Pathol132：489-502；Nakamura等，1993“Liverallograftrejectioninsensitizedrecipients.ObservationsinaClinicallyRelevantSmallAnimalModel”AmJ.Pathol.142：1383-91；Furuya等1992.“PreformedLymphocytotoxicAntibodies：theEffetsofClass，TiterandSpecificityonLivervHeartAllografts”Hepatology16：1415-22；Tector等2001.“RejectionofPigHiverXenograftsinPatientswithLiverFailure：ImplicationsforXenotransplantation”，LiverTranspl第82-9页；其通过引用整体并入本文。例如，血小板减少性凝血病的早期发生是猪肝异种移植后非人灵长类动物接受者死亡的主要因素。然而，如果抗体介导的异种移植排斥(antibodymediatedxenograftrejection，AMXR，AMR)被阻止，则猪肾的非人灵长类动物(non-humanprimate，NHP)接受者就不会发生显著的血小板减少症，也不会表现出凝血病的临床表现。参见例如Ekser等，2012“GeneticallyEngineeredPigtoBaboonLiverXenotransplantation：HistopathologyofXenograftsandNativeOrgans”PLoSONE第e29720页；Knosalla等2009，“RenalandCardiaEndothelialHeterogeneityImpactAcuteVascularRejectioninPigtoBaboonXenotransplantation”，AmJTransplant1006-16；Shimizu等2012.“PathologicCharacteristicsofTransplantedKidneyXenografts”，J.Am.Soc.Nephrology225-35；其通过引用整体并入本文。除了需要用于移植的器官、组织和细胞之外，用于输血的安全血液也短缺。每年在美国进行使用包装的人红细胞(RBC)的1100万次输血(NationalBloodDataSource，1998)。美国的血液供应长期不足。在2001年，预计美国血库将获得比最佳期望少约250,000个单位。官员们例行地预测在当常规献血者休假以及大学生也离开主要城市中心的夏季月份期间会有严重的国家短缺。由于国家拥有稳健且有竞争力的血液收集和分配系统，因此周期性短缺通常不会导致死亡，但是选择性手术(electivesurgery)可能需要推迟，并且非重要需求不能得到满足。由于正常捐献的血液只能储存约42天并且少于5％的合格捐献者献血，恶劣的天气条件(例如暴风雪或飓风)常常导致危险的低血液储备。人血液不仅是稀缺资源，而且其对于接受者也有潜在的风险。尽管有病毒筛选过程，但是捐献的人血液不是100％安全的(FDA，血液采集和输血后向FDA报告的死亡的年度总结(AnnualSummaryofFatalitiesReportedtotheFDAFollowingBloodCollectionandTransfusion)，FY2013)。普通人群中丙型肝炎和HIV的发病率使得献血制品昂贵且难以检测。由于确保人血液中没有任何感染性微生物困难且费用高，因此非常希望开发数量不限且不含感染原的红细胞和其他输血产品的来源。猪细胞表达未见于人细胞中的α(1，3)半乳糖基转移酶(α(1，3)galactosyltransferase，αGal)和胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidinemonophosphate-N-acetylneuraminicacidhydroxylase，CMAH)。猪细胞还表达猪β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β1，4N-acetylgalactosaminyltransferase，β4GalNT2)；认为许多人表达β4GalNT2的形式(Morton等(1970)VoxSang19：472-482)。αGal酶催化糖蛋白上半乳糖-α1，3-半乳糖(αGal)残基的形成。CMAH将唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)转化为N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。猪β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β4GalNT2)催化将N-乙酰半乳糖胺末端添加至唾液酸修饰的乳糖胺以产生Sda样抗原，包括但不限于Sda和GalNAcβ1，4[Ne本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因猪，其在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)‑半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中与野生型猪相比，α(1，3)‑半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.22 US 62/067,1291.转基因猪，其在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低。2.分离自权利要求1的所述转基因猪的猪器官、组织、输血产品或细胞。3.权利要求2所述的猪器官、组织或细胞，其中所述猪器官、组织、输血产品或细胞选自：皮肤、心、肝、肾、肺、胰、甲状腺、小肠、血液及其组分。4.权利要求1所述的转基因猪，其中与将来自野生型猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人相比，将来自所述猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人时，排斥相关症状改善。5.权利要求4所述的转基因猪，其中将来自所述猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人时，所述排斥相关症状选自包含以下的组：细胞排斥反应相关症状、体液排斥反应相关症状、超急性排斥相关症状、急性体液异种移植反应排斥相关症状和急性血管排斥反应相关症状。6.权利要求4所述的转基因猪，其中与将来自野生型猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人相比，将来自所述猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人时，血小板减少症降低。7.权利要求1所述的转基因猪，其中与将来自野生型猪的肝暴露于人血小板时相比，将来自所述转基因猪的肝暴露于人血小板时，所述肝显示出降低的血小板摄取。8.从权利要求1所述的转基因猪获得的皮肤相关产品，其中所述皮肤相关产品显示出减轻的与伤口过早分离。9.权利要求8所述的皮肤相关产品，其中所述伤口是人皮肤伤口。10.权利要求4所述的转基因猪，其中与将来自野生型猪的肾移植给人相比，将来自所述转基因猪的肾移植给人时，排斥相关症状降低。11.制备用于异种移植到人中的移植材料的方法，所述方法包括提供权利要求1所述的转基因猪作为所述移植材料的来源，并且其中所述移植材料选自器官、组织、输血产品和细胞，并且其中所述移植材料具有降低的αGal抗原水平、降低的Neu5GC抗原水平和降低的Sda样抗原水平。12.转基因猪，其在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：与G至A替换相邻的3碱基对缺失，单碱基对缺失、单碱基对插入、二碱基对插入、六碱基对缺失、十碱基对缺失、七碱基对缺失，五碱基对缺失的八碱基对插入，五碱基对插入、十一碱基对缺失和十八碱基对缺失；其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：四碱基对插入、一碱基对缺失、二碱基对缺失、三碱基对缺失、五碱基对缺失、八碱基对缺失、二十碱基对缺失、十一碱基对缺失、十二碱基对缺失、单碱基对插入，单碱基对缺失的二碱基对插入，四碱基对插入的三碱基对缺失，六十六碱基对缺失和十二碱基对插入、以及伴有一碱基对替换的五碱基对缺失；其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、五碱基对缺失、十四碱基对缺失、十二碱基对缺失和一碱基对替换、伴有一碱基对插入的271碱基对缺失、以及单碱基对插入，并且其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低，并且与将来自野生型猪的组织移植给人相比，将来自所述转基因猪的组织移植给人时，超急性排斥相关症状改善。13.权利要求12所述的转基因猪，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下的组：五碱基对缺失、七碱基对缺失、以及五碱基对缺失和七碱基对缺失二者，其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、以及三碱基对缺失的四碱基对替换，其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、五碱基对缺失和单碱基对插入，并且其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低，并且与将来自野生型猪的组织移植给人相比，将来自所述转基因猪移植给人时，超急性排斥相关症状改善。14.权利要求12所述的转基因猪，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：十一碱基对缺失和十八碱基对缺失，其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：六十六碱基对缺失/十二碱基对插入和五碱基对缺失/一碱基对替换，其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十四碱基对缺失、十二碱基对缺失和271碱基对缺失/1碱基对插入，并且其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低，并且与将来自野生型猪的组织移植给人相比，将来自所述转基因猪的组织移植给人时，超急性排斥相关症状改善。15.使将人对象鉴定为需要人器官移植的对象与进行人器官移植之间的持续时间延长的方法，所述方法包括提供来自转基因猪的器官，所述转基因猪在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中在所述猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达与野生型猪相比降低；以及以治疗有效的方式将来自所述转基因猪的所述器官与所述人对象通过手术连接。16.权利要求15所述的方法，其中来自所述转基因猪的...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫·A·泰克托尔，
申请(专利权)人：印第安纳大学研究与技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US