一株铜绿假单胞菌XCS007及其在防治烟草黑胫病中的应用制造技术

一株铜绿假单胞菌XCS007，分类名为Pseudomonas aeruginosa，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月5日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12330。铜绿假单胞菌XCS007可高效产生几丁质酶，最高活性达到12.25U/mL，对烟草黑胫病菌有优良的拮抗作用：菌液及菌液粗提物对烟草黑胫病菌菌丝抑制率达到91％以上。生防效果好：对接种烟草黑胫病菌的烟草植株，菌液及菌液粗提物的防治效果均能达到80％以上。用于生物防治对环境友好、不易产生抗药性、对人畜安全，为烟草绿色防控发展创造条件。

【技术实现步骤摘要】
一株铜绿假单胞菌XCS007及其在防治烟草黑胫病中的应用
本专利技术属于生物防治
，具体涉及一株铜绿假单胞菌XCS007及其在防治烟草黑胫病中的应用。
技术介绍
烟草黑胫病是一种重要的真菌性土传病害，由寄生疫霉烟草致病变种(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)引起。烟草黑胫病可以侵染和危害烟草任何生长阶段和现有栽培品种，平均发病率高达10％以上，常表现为黑胫、穿大褂、黑膏药、碟片状、烂腰等症状。防治烟草黑胫病通常采用抗病品种的选育、化学防治、生物防治、加强栽培管理等措施，但是化学农药的滥用易诱发病原菌产生抗药性，烟草抗病品种随着使用年限的增加抗病性逐渐丧失等问题突出。生物防治具有对环境友好、不易产生抗药性以及对人畜安全等优势，可为烟草绿色防控发展创造条件，尤其是生防菌(拮抗菌)的筛选与应用作为其重要内容成为发展的必然趋势，具有巨大的潜在应用和推广价值。研究表明，生防菌主要通过产生多种抗生代谢产物和酶类、竞争病原菌的营养和空间位点、诱导植物系统抗病性等多种方式来保护植物免受病原菌的危害。防治烟草黑胫病的生防菌广泛存在于植物体内或土壤中，主要包括细菌(如芽胞杆菌属、假单孢菌属)、真菌(如木霉属、青霉菌属)和放线菌(如链霉菌属)等，其中芽胞杆菌和假单胞菌研究和应用的较多。几丁质(Chitin)是多数病原真菌的细胞壁和昆虫体壁的主要组成成分，但不存在于植物细胞壁中。在1905年，Benecke首次发现贝内克氏菌内的几丁质酶能够降解几丁质后，对几丁质酶的研究得到长足发展。现已有研究表明，几丁质酶能在体外抑制木霉(Trichodermaviride)、指状青霉(Penicilliumdigitatum)，炭疽菌(Colletitrochumlindemuthianum)、寄生隐从赤孢菌(Cryphonectriaparasitica)、茄链格孢、TMV等的生长，可增强植物抗真菌病害的能力。另外，几丁质酶的活性底物还有其它物质活性，包括溶菌酶活性、抑制昆虫淀粉酶活性、核糖体失活蛋白的活性、肌动蛋白结合活性、脱乙酰壳多糖酶活性、参与催化转糖基反应等。同时，几丁质降解产物-几丁寡糖在离体条件下对烟草黑胫病具有显著防治效果，能显著提高烟草体内的SOD、POD、PPO和几丁质酶活性。目前虽有生防菌的相关研究，但是其防治烟草黑胫病的效果较差，很少产生几丁质酶，且即使产生几丁质酶，其活性也较低。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术旨在提供一株高几丁质酶活性的生防菌，能有效防治烟草的黑胫病。一株铜绿假单胞菌XCS007，分类名为Pseudomonasaeruginosa，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月5日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12330。进一步地，铜绿假单胞菌XCS007的菌体呈棒状，革兰氏染色显阴性。进一步地，所述铜绿假单胞菌XCS007的培养基组份为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L。进一步地，所述铜绿假单胞菌XCS007的培养条件为：27-33℃、pH6.5-7.5、100-200r/min恒温震荡培养24-72h。优选30℃、pH7.0、150r/min恒温震荡培养48h。上述铜绿假单胞菌XCS007在防治烟草黑胫病中的应用。进一步地，铜绿假单胞菌XCS007应用的形式为菌液，应用方式为灌根，每株烟苗灌根量共1×107-9×107个菌体。更进一步地，灌根采用分2-3次灌根的形式，第一次在烟株生长到8-10片真叶时，以后每隔7天灌根一次。更进一步地，每次灌根量相同。进一步地，铜绿假单胞菌XCS007应用的形式为菌液粗提物，应用方式为灌根，每株烟苗灌根所用粗体物的总量来自于1×109-9×109个菌体。更进一步地，灌根采用分2-3次灌根的形式，第一次在烟株生长到8-10片真叶时，以后每隔7天灌根一次。更进一步地，每次灌根量相同。本专利技术从烟草根际土壤中分离筛选到1株对烟草黑胫病菌具有较好拮抗活性的铜绿假单胞菌XCS007，具有以下优势：(1)可高效产生几丁质酶，最高活性达到12.25U/mL，由于几丁质酶广泛存在于动、植物、真菌、病毒、细菌、放线菌中，参与多种生理过程，植物防卫和抗逆反应，因此对烟草真菌性病害的防治提供了新的途径。(2)对烟草黑胫病菌有优良的拮抗作用：菌液对烟草黑胫病菌菌丝抑制率达91.80％，菌液粗提物对烟草黑胫病菌菌丝抑制率达97.11％。(3)生防效果好：在盆栽试验中，分别用菌液及菌液粗提物处理接种烟草黑胫病菌的烟草植株，防治效果分别达到83.18％和83.55％；在大田试验中，分别用菌液及菌液粗提物处理接种烟草黑胫病菌的烟草植株，防治效果分别达到78.64％、79.54％；和58％甲霜·锰锌防治效果相当，且优于生物制剂枯草芽胞杆菌，在烟草黑胫病的生物防治方面具有潜在的应用价值，发展和应用前景良好。(4)生物防治对环境友好、不易产生抗药性、对人畜安全，为烟草绿色防控发展创造条件。附图说明图1在对峙培养中，菌株XCS007对黑胫病菌的抑制效果(处理组中箭头所指为抑菌带)；图2利用牛津杯法，菌株XCS007粗提物对黑胫病菌的抑制效果；图3菌株XCS007对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制作用(400×)；图4菌株XCS007培养滤液的几丁质酶活性变化；图5在扫描电镜下菌株XCS007的形态图6根据16SrRNA基因序列构建的菌株XCS007系统发育树；图7温度、pH和培养时间对菌株XCS007生长量的影响。生物材料样品保藏信息：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)XCS007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年4月5日，保藏编号为CGMCCNo.12330。具体实施方式下面结合具体实施例及附图对本专利技术做进一步详细说明。所有实施例中用到的材料如下：主要试剂和材料如下：DNA快速提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，货号EE161-01)；几丁质(Sigma，货号C7170-100G)；N-乙酰-D-氨基葡萄糖(北京索莱宝科技有限公司，货号N8420)；革兰氏染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号G1060)；58％甲霜·锰锌可湿性粉剂(江苏宝灵化工股份有限公司)；枯草芽胞杆菌可湿性粉剂(德强生物股份有限公司)；其他药剂均为国药分析纯(AR)。烟草品种：红花大金元(易感品种)，由国家烟草改良中心提供。烟草黑胫病菌(Phytophthoranicotianae)：由国家烟草改良中心提供。数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，KQ500DA型。旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂，SY-5000型。拮抗菌分离、培养和测定所用的培养基如下：拮抗菌的培养和分离选用营养琼脂培养基NA(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，调节pH6.8)，和营养肉汤培养基NB(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1L)。抑菌活性测定选用燕麦培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株铜绿假单胞菌XCS007，分类名为Pseudomonas aeruginosa，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月5日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12330。

【技术特征摘要】
1.一株铜绿假单胞菌XCS007，分类名为Pseudomonasaeruginosa，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月5日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12330。2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌XCS007，其特征在于，所述铜绿假单胞菌XCS007的菌体呈棒状，革兰氏染色显阴性。3.根据权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌XCS007，其特征在于，所述铜绿假单胞菌XCS007的培养基组份为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L。4.根据权利要求3所述的铜绿假单胞菌XCS007，其特征在于，所述铜绿假单胞菌XCS007的培养条件为：27-33℃、pH6.5-7.5、100-200r/min恒温震荡培养24-72h。5.根据权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁朝强，陈德鑫，徐同伟，胡勇，杨艺炜，祖庆学，林松，吴永琴，李余江，
申请(专利权)人：贵州省烟草公司贵阳市公司，中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：贵州,52