一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法技术

本发明专利技术为一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法，提供一种烟碱暴露神经细胞差异蛋白质组的分析方法。具体而言，神经细胞经含有烟碱的培养基培养后，经蛋白质的抽提，蛋白浓度、样品质量及平行性的测定，酶解，iTRAQ标记和nano‑LC‑Q‑TOF分析鉴定后，进行搜库分析。本发明专利技术的方法定量分析了1mmol/L烟碱暴露1h SHSY‑5Y蛋白质的差异表达，其中参与MAPK级联生物过程和蛋白酶体信号通路的蛋白酶体蛋白，可能在烟碱成瘾中发挥重要作用，从而达到了解烟碱诱导神经细胞的差异表达蛋白质及差异蛋白质参与的生物过程的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法
本专利技术涉及生物检测
，更具体而言，本专利技术涉及烟碱暴露神经细胞中差异表达蛋白质的测定方法。
技术介绍
烟碱是奖励习惯性抽烟的主要成分，是导致吸烟成瘾的主要原因。吸烟时，烟碱随烟气经口腔到达肺部后，被肺泡中的毛细血管吸收，由肺部静脉循环经心脏进入体循环动脉系统，在吸烟后约10-20秒进入大脑，与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)结合，使受体的离子通道打开，钙离子和钾离子等进入神经元，诱导一系列生物过程的改变而导致成瘾。蛋白质是生命活动的体现者，研究表明反复接触成瘾药物包括烟碱、吗啡、大麻等可以引起大脑特定区域蛋白质表达水平的改变，这种表达的改变不仅参与单个神经元和相关神经回路的调节，还可能对成瘾相关的异常行为产生影响。因此，识别参与形成和维持药物依赖的蛋白是理解药物成瘾潜在分子机制的关键。目前关于蛋白质表达的测定方法报道很多。蛋白质组学技术能够动态监测蛋白质的变化，是鉴定烟碱诱导蛋白质表达的主要方法。相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)是由ABSCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：1)样品前处理：将细胞分成实验组和对照组，分别在含或不含烟碱的细胞培养基中培养，然后提取细胞全蛋白；2)蛋白质酶解：分别对步骤1)得到的实验组和对照组的细胞全蛋白依次进行还原和烷基化处理，然后在适合酶解的条件下加入胰蛋白酶，收集酶解得到的肽段；3)iTRAQ标记：采用不同分子量的iTRAQ试剂标记步骤2)得到的实验组的肽段和对照组的肽段，将经标记的两组肽段混合，除盐，冻干；4)nano‑LC‑Q‑TOF测定：将步骤3)得到的肽段混合物上样到nano‑LC‑Q‑TOF中，进行液相色谱‑质谱分析；5)差异蛋白筛选：将...

【技术特征摘要】
1.一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：1)样品前处理：将细胞分成实验组和对照组，分别在含或不含烟碱的细胞培养基中培养，然后提取细胞全蛋白；2)蛋白质酶解：分别对步骤1)得到的实验组和对照组的细胞全蛋白依次进行还原和烷基化处理，然后在适合酶解的条件下加入胰蛋白酶，收集酶解得到的肽段；3)iTRAQ标记：采用不同分子量的iTRAQ试剂标记步骤2)得到的实验组的肽段和对照组的肽段，将经标记的两组肽段混合，除盐，冻干；4)nano-LC-Q-TOF测定：将步骤3)得到的肽段混合物上样到nano-LC-Q-TOF中，进行液相色谱-质谱分析；5)差异蛋白筛选：将步骤4)得到的数据导入mascot软件对Uniprot-human数据库进行搜库，筛选差异表达蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述细胞为神经细胞，优选为神经母瘤细胞；优选地，烟碱在细胞培养基中的浓度为1mmol/L；优选地，所述步骤1)包括以下步骤：细胞随机分为实验组和对照组两组，在37℃和5％CO2下，实验组在含有1mmol/L烟碱的培养基中、对照组在不含烟碱相同的培养基中培养1小时，然后收集细胞，提取细胞全蛋白，其中所述培养基为含有10％血清和1％双抗的DMEM培养基。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，采用还原剂进行细胞全蛋白的还原处理，所述还原剂为10mMDTT、8M尿素、0.1MTris-HCl，pH8.5；优选地，采用烷基化剂进行细胞全蛋白的烷基化处理，所述烷基化剂为50mMIAA、8M尿素、0.1MTris-HCl，pH8.5；优选地，所述还原和烷基化处理包括：向细胞全蛋白溶液中加入4倍体积所述还原剂，在37℃下孵育1小时，然后在避光条件下加入与还原剂相同体积的所述烷基化试剂，在室温下放置20分钟。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，按细胞全蛋白和酶的质量比为20:1的比例向经过还原和烷基化处理的细胞全蛋白中加入胰蛋白酶；优选地，所述胰蛋白酶酶解包括：按细胞全蛋白和酶的质量比为20:1的比例向经过还原和烷基化处理的细胞全蛋白中加入胰蛋白酶，在37℃下孵育16小时，收集分子量小于10kd的肽段。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)包括以下步骤：2-1)取100μg细胞全蛋白用细胞裂解液配制成30μL体积的细胞全蛋白溶液，加入现配4倍体积的还原剂，在37℃下孵育1小时，然后在避光条件下加入与还原剂相同体积的烷基化试剂，在室温下放置20分钟；2-2)将经还原和烷基化处理的蛋白溶液移入10kd的超滤管中，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡清源，朱贝贝，侯宏卫，陈欢，李翔宇，王红娟，付亚宁，陈建，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：河南,41