一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物检测仪器领域，具体涉及一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器，其组成包括：绝缘基板、电极系统、检测试剂、中隔层、覆盖层以及反应室及进样通道，所述的反应室设有透气孔，其中，所述的检测试剂中的酶为黄素腺嘌呤二核苷酸依赖型葡萄糖脱氢酶，电子介体由钌络合物和2,6‑二氯酚靛酚共同组成。还提供了该生物传感器的检测方法。本发明专利技术解决了单纯钌络合物很难从黄素腺嘌呤二核苷酸依赖型葡萄糖脱氢酶上接受电子的问题，使生物传感器的反应灵敏度、线性良好。

【技术实现步骤摘要】
一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器及检测方法
本专利技术涉及生物检测仪器领域，具体涉及一种基于黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶的生物传感器及检测方法。
技术介绍
生物传感器(biosensor)，是一种利用生物活性物质选择性识别目标物质并将其浓度或含量转换为电信号进行检测的仪器，是由固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质）、适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统。电化学生物传感器已经被广泛应用于体外诊断领域，这些仪器系统能检测体液中的生理物质，方便医生对病人状况分析和诊断，也有一些仪器系统应用到家庭使用，方便病人的自我监控，这些生理指标包括血糖、胆固醇、尿酸、甘油三酸酯、乳酸、酮体、酶类等。生物传感器已经被广泛应用于临床检测中，其中最普及的例子是便携式血糖测试系统，便携式血糖测试系统已经成为糖尿病人或医疗卫生机构进行血糖监测和管理必不可少的工具。目前便携式血糖测试系统基本都基于生物酶促反应的原理，主要使用两种类型的酶：1）葡萄糖氧化酶；2）葡萄糖脱氢酶。葡萄糖氧化酶的应用历史悠久，它具有特异性高、稳定性好等优点，非常适合应用于血糖的检测；但是葡萄糖氧化酶会和氧气发生反应，氧气可以作为电子受体从葡萄糖氧化酶接受氧化葡萄糖获取的电子，因此样本中的氧气含量差别会造成结果的偏差，而实际使用中可能检测的血样包括静脉血、动脉血、毛细血管血等氧气含量不同的样本，不同海拔的人群、吸氧治疗的人群、操作的因素都会造成血样氧气含量的变化，因此应用葡萄糖氧化酶的便携式血糖测试系统的应用具有局限性，不适合血样氧气含量变化的场合，特别是医疗机构。葡萄糖脱氢酶不会和氧气发生反应，因此不会受样本中氧气含量的干扰，适用于检测不同氧气含量的样本。葡萄糖脱氢酶分为三种类型：1）吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型；2）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖型；3）黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型。吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型的葡萄糖脱氢酶底物特异性不好，易受结构类似的糖（如麦芽糖、半乳糖等）干扰，造成结果偏高，对于透析治疗的病人不适用，FDA2009年针对使用这类酶的便携式血糖测试系统发布了可能造成致命错误危险的警告。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖型的葡萄糖脱氢酶底物特异性良好，但是开发生物传感器难度很大，目前应用不广。黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型的葡萄糖脱氢酶因其良好的底物特异性和稳定性，目前是血糖生物传感器开发的热点。目前应用黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶的血糖生物传感器，普遍采用铁氰化钾作为电子介体。铁氰化钾成本低、水溶性好、和酶的配合性好，非常适合作为生物传感器的电子介体，但是铁氰化钾在生物传感器中，随着存储时间、光、热等因素的影响，会发生氧化还原反应，生成亚铁氰化钾，干扰生物传感器的检测和准确度。US20130026050A1披露了采用四甲基铵（TMA）的铁氰盐来改善这个问题。钌化合物因其具有良好的稳定性和水溶性，以它作为电子介体的生物传感器的背景噪音会比较低，因此近来也被广泛应用到生物传感器，US6726818B2的实施例里介绍了一种采用六氨三氯化钌和葡萄糖氧化酶的生物传感器。但是钌化合物和酶的配合性比较差，在传统的配方中以钌化合物为电子介体和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶为反应酶的生物传感器反应信号很弱或几乎没有。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题和缺陷，本专利技术的目的旨在利用黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶特异性好、无氧含量干扰的优点，结合钌络合物稳定性好、背景噪音低等优点，解决两者反应配合性的问题，开发一种高性能的基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器，并利用该生物传感器能反应灵敏的检测样本中葡萄糖含量。为实现本专利技术的目的，专利技术人提供如下的技术方案：专利技术概述本专利技术首先是提供了一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器（用于检测样本中葡萄糖含量），其组成包括：绝缘基板；构建在绝缘基板上的电极系统，所述的电极系统至少包括一条工作电极和一条对电极；至少应该覆盖工作电极且固定在电极系统上的检测试剂；构建在电极系统和检测试剂上方的中隔层，所述的中隔层在进样通道及反应室区域镂空；构建在中隔层上方的覆盖层，所述的覆盖层、中隔层和绝缘基板构建成反应室及进样通道（样本可通过毛细虹吸作用自动进样）；所述的反应室设有透气孔（以便形成虹吸作用），其中，所述的检测试剂中的酶为黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶，电子介体由钌络合物和2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)共同组成。本专利技术中钌络合物和2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)组成复合电子介体参与反应。样本进入反应室后，检测试剂溶解，检测试剂中的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶和样本中的葡萄糖接触并发生氧化还原反应，钌络合物和2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)组成的复合电子介体一起参与了酶和电极之间的电子传递过程，解决了单纯钌络合物很难从黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶上接受电子的问题，使生物传感器的反应灵敏度、线性良好。作为优选，本专利技术的生物传感器中，所述的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶的用量范围约为每个生物传感器0.1U~20U，更优选的是1~5U，具体的最适用量取决产品的具体设计。本专利技术检测试剂中采用的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型葡萄糖脱氢酶，目前已经有多个商业化的产品可供选择，如BBI公司的GLD-1、GLD-3，SekisuiEnzymes公司的GLDE-70-1192等。本专利技术采用钌络合物和2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)组成的复合电子介体。可作为生物传感器电子介体的钌络合物有多种形式，在生物传感器中通常使用其氧化态。作为优选，本专利技术的生物传感器中，所述的钌络合物符合如下通用化学式：[Ru(NH3)5X]n+，式中X包括NH3、CN、卤素离子等；n+是氧化态的Ru(III)和其他基团组合的整个化学式的价位。钌络合物最常用的例子是六氨合三氯化钌Ru(NH3)6Cl3（CASNo.14282-91-8）。在生物传感器中钌络合物的用量范围约为每个生物传感器1ug~80ug，更优选的是10~30ug，具体的最适用量取决产品的具体设计。作为优选，本专利技术的生物传感器中，所述的2,6-二氯酚靛酚（即2,6-Dichlorophenolindophenol，简称为DCPIP或DPIP)是它的盐或水合物，比较常用的是它的钠盐—2,6-二氯酚靛酚钠（CASNo.620-45-1）。在生物传感器中2,6-二氯酚靛酚的用量范围约为每个生物传感器0.05ug~10ug，更优选的是0.2~2ug，具体的最适用量取决于产品的具体设计。本专利技术还提供了一种利用上述生物传感器用于检测样本中葡萄糖含量的检测方法，所述的生物传感器配备仪器进行检测，包括：生物传感器插入仪器接口中，生物传感器的电极系统通过电极的引线接触端和仪器接口的接触件联通，仪器因此可以对生物传感器的电极系统施加电位差，施加电位差的高低由电子介体的氧化电位决定，本专利技术的施加的电位差范围为0.15~0.4V，优选0.2~0.3V。当样本进入生物传感器的反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器，其组成包括：绝缘基板；构建在绝缘基板上的电极系统，所述的电极系统至少包括一条工作电极和一条对电极；至少应该覆盖工作电极且固定在电极系统上的检测试剂；构建在电极系统和检测试剂上方的中隔层，所述的中隔层在进样通道及反应室区域镂空；构建在中隔层上方的覆盖层，所述的覆盖层、中隔层和绝缘基板构建成反应室及进样通道；所述的反应室设有透气孔，其特征在于，所述的检测试剂中的酶为黄素腺嘌呤二核苷酸依赖型葡萄糖脱氢酶，电子介体由钌络合物和2,6‑二氯酚靛酚共同组成。

【技术特征摘要】
1.一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器，其组成包括：绝缘基板；构建在绝缘基板上的电极系统，所述的电极系统至少包括一条工作电极和一条对电极；至少应该覆盖工作电极且固定在电极系统上的检测试剂；构建在电极系统和检测试剂上方的中隔层，所述的中隔层在进样通道及反应室区域镂空；构建在中隔层上方的覆盖层，所述的覆盖层、中隔层和绝缘基板构建成反应室及进样通道；所述的反应室设有透气孔，其特征在于，所述的检测试剂中的酶为黄素腺嘌呤二核苷酸依赖型葡萄糖脱氢酶，电子介体由钌络合物和2,6-二氯酚靛酚共同组成。2.根据权利要求1所述的一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器，其特征在于，所述的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖型葡萄糖脱氢酶的用量范围为每个生物传感器0.1U~20U。3.根据权利要求1所述的一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器，其特征在于，所述的钌络合物符合如下通用化学式：[Ru(NH3)5X]n+，式中X包括NH3、CN、卤素离子，n+是氧化态的Ru(III)和其他基团组合的整个化学式的价位；钌络合物的用量范围为每个生物传感器1...

【专利技术属性】
技术研发人员：章子毅，李红，周嘉强，郑芬萍，李霖，吴建平，王天星，
申请(专利权)人：台州亿联健医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33