一种母乳内源性抗菌多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种母乳内源性抗菌多肽及其应用，该多肽是从人类母乳β‑酪蛋白分离的含有十七个氨基酸的多肽，对小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌同时具有显著的抑菌效果，通过电镜扫描发现其主要通过破坏细菌细胞膜的完整性从而抑制细菌，利用该多肽可制备抗小肠结肠炎耶尔森菌、抗大肠杆菌、抗金黄色葡萄球菌的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种母乳内源性抗菌多肽及其应用
本专利技术涉及生物工程领域，具体地说涉及一种母乳内源性抗菌多肽及其应用。
技术介绍
自1939年第一种抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)从土壤芽孢杆菌中被分离以来，在不同生物中陆续发现了2490多种抗菌肽，并且新的抗菌肽还在不断地开发和鉴定中。抗菌肽是一类由5～100个氨基酸组成的寡肽，具有广谱的抗菌活性，作用靶标包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、病毒、寄生虫以及肿瘤细胞等，使它迅速成为潜在的治疗药物。抗菌肽的杀菌机制包括通过破坏细胞膜的完整性，抑制蛋白、DNA和RNA的合成，或与胞内某些特定的靶标相结合从而杀死细菌。一般来说，一种抗菌肽仅对一类微生物有效，但是也有一些例外的抗菌肽针对不同的微生物具有不同的杀伤机制，例如抗菌肽indolicidin不仅可以通过渗透细胞抑制DNA的合成杀伤大肠杆菌，而且可以通过损伤真菌细胞膜杀伤真菌，还可以抑制HIV-整合酶抑制HIV活性。还有一些抗菌肽对不同类型微生物具有相同的杀伤模式，PMAP-23能够在细胞膜形成孔隙杀死真菌和寄生虫。抗菌肽不仅可以破坏微生物细胞膜而且可以抑制功能蛋白的合成产生快速杀伤效应的独特机制使其成为理想的抗生素替代品。耐药菌、生物被膜、滞留菌对传统抗生素具有很强的抗性，并且它们在感染中发挥着重要作用。利用抗菌肽破坏细胞膜的效应杀死耐药菌以及对生物被膜基质蛋白酶的作用清除生物被膜，可以有效控制感染的发生，因此具有潜在的开发应用价值。研究报道母乳强大的抗感染能力主要取决于其成份组成，如：母乳寡糖(Oligosaccharides)和乳铁蛋白可促进益生菌的生长，平衡新生儿肠道菌群抵御外界病原体的入侵；乳凝集素可通过抑制Toll样受体信号通路抵抗病菌感染。近年来，母乳已被鉴定出含有超过300种内源性多肽，其中β-防御素2具有广谱抗菌活性，对沙门氏菌和大肠埃希菌等具有杀伤作用；胰高血糖素样肽2可显著提高坏死性小肠结肠炎的发生率，减少肠道中炎症因子TNF-α、IL-6的分泌。多肽作为药物，不仅具有大分子药物的精确，而且还具备小分子药物的高效，更兼具药物的安全性优势，在抗肿瘤和代谢性疾病等多项领域中均受到越来越多的重视，如利拉鲁肽和艾塞那肽可成功治疗糖尿病。因此从母乳内源性多肽的角度寻找抗菌肽对临床抗感染治疗具有积极的作用。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种母乳内源性抗菌多肽，本专利技术还有一个目的是提供编码前述多肽的核苷酸，本专利技术还有一个目的是提供含有前述核苷酸序列的表达载体；本专利技术还有一个目的是提供前述表达载体转染的宿主细胞；本专利技术还有一个目的是提供含有前述多肽的组合物；本专利技术还有一个目的是提供前述多肽在制备抗小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌药物上的应用。技术方案：本专利技术所述的一种分离的内源性抗菌多肽，其通式为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。β-Casein197(氨基酸序列SEQIDNO.1)：Leu-Leu-Asn-Gln-Glu-Leu-Leu-Leu-Asn-Pro-Thr-His-Gln-Ile-Tyr-Pro-Val。本专利技术所述的母乳内源性抗菌多肽来源于人类母乳中的β-酪蛋白，为经过筛选可同时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌具有优秀抑菌效果的天然内源性抗菌多肽。本专利技术的多肽对小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌同时具有较好的抑菌效果，结构稳定，不易在体内降解。所述多肽的获得可按照氨基酸序列通过固相合成方法获得；或者通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的DNA片段，通过现有的重组DNA技术制备获得。所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pET载体、pGEX载体；宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)，放线菌(Actinomycetes)，芽孢杆菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)，本专利技术所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。本专利技术还提供编码前述多肽的核苷酸，其为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术还提供含有前述多肽的组合物。所述多肽或所述多肽组合物可制备成药学上可接受的载体，包括但不限于胶囊、片剂、锭剂、丸剂、滴丸、栓剂、喷雾、乳膏、贴剂等形式。本专利技术所述多肽对小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有显著抑菌效果，通过电镜扫描发现其主要通过破坏细菌细胞膜的完整性从而抑制细菌。可用于制备抗小肠结肠炎耶尔森菌、抗大肠杆菌、抗金黄色葡萄球菌的药物。附图说明图1为试验例1中β-Casein197的抑菌效果图；图2为试验例2中β-Casein197荧光显微镜下观察的染色结果；图3为试验例3的试验菌在β-Casein197处理下的扫描电镜图；图4为试验例3的试验菌在β-Casein197处理下的透射电镜图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。实施例1委托上海科肽生物科技有限公司通过固相法合成如下SEQIDNO.1所示序列：Leu-Leu-Asn-Gln-Glu-Leu-Leu-Leu-Asn-Pro-Thr-His-Gln-Ile-Tyr-Pro-Val这是十七个氨基酸组成的多肽，通过在线工具获取前述多肽序列的主要生物学参数如下：等电点(pI)为5.24，分子质量(Mw)2005.34Da，较低的相对分子质量表明该抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不稳定系数为33.2，表明该抗菌多肽较为稳定，不易被胃酸所降解破坏。脂溶指数和亲水性分别为154.71和0.106，表现为弱的疏水性。上述序列为来源于人类母乳中β-酪蛋白的天然序列，除了通过化学固相合成法获得，还可以通过对长链多肽通过生物酶切技术获得，亦可通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的DNA片段，通过现有的重组DNA技术制备获得。所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pET载体、pGEX载体；宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)，放线菌(Actinomycetes)，芽孢杆菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)，本专利技术所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。编码上述多肽的核苷酸序列对应如下：CTGCTCAACCAAGAACTTCTACTTAACCCCACCCACCAGATCTACCCTGTG实施例2实施例1所述的多肽可以单独应用，除此之外，这些多肽还可以多肽组合物联合使用。多肽组合物中包含序列为SEQIDNO.1的多肽。实施例3本实施例提供前述实施例1所述的一种多肽，或者实施例2所述的多肽组合物可制备成药学上可接受的载体，例如：胶囊、片剂、锭剂、丸剂、滴丸、栓剂、喷雾、乳膏、贴剂等形式。试验例1抑菌试验抗菌多肽的合成与稀释本试验实施例1中固相合成获得的抗菌多肽β-Casein197多肽分别为例。取1mg多肽，用无菌双蒸水稀释成1mg/ml-20℃储存备用。菌株及培养大肠杆菌(E.coli，ATCC25922)、金黄本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种母乳内源性抗菌多肽，其通式为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种母乳内源性抗菌多肽，其通式为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述母乳内源性抗菌多肽的核苷酸，其为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述核苷酸序列的表达载体。4.权利要求3所述表达载体转染的宿主细胞。5.含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭锡熔，王兴，崔县伟，季晨博，尤梁惠，谢开鹏，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏,32