缀合物的制备方法技术

本发明专利技术涉及制备细胞结合剂与药物(例如细胞毒性化合物)的缀合物的方法。所述方法包括使用亚胺反应性化合物以使细胞毒性化合物与细胞结合剂有效缀合。

Process for the preparation of conjugates

The present invention relates to methods for preparing conjugates of cellular binders and drugs (e.g., cytotoxic compounds). The method comprises the use of imine reactive compounds to effectively bind cytotoxic compounds to cellular binders.

【技术实现步骤摘要】
缀合物的制备方法本申请为国际申请PCT/US2012/025257进入中国国家阶段的中国专利申请(申请号为201280018499.8，其申请日为2012年2月15日，专利技术名称为“缀合物的制备方法”)的分案申请。参考相关申请本申请要求提交于2011年2月15日的美国临时申请No.61/443,062、提交于2011年5月6日的美国临时申请No.61/483,499和提交于2011年2月15日的美国临时申请No.61/443,092在35U.S.C.§119(e)下的提交日期的权益，其全部内容(包括所有附图、化学式、说明书和权利要求)通过引用并入本文。专利
本专利技术描述亚胺反应剂用于制备细胞结合剂与含有一个或多个亚胺官能团的DNA-结合细胞毒性药物的缀合物的用途。专利技术背景单克隆抗体越来越多地被开发为癌症的治疗剂。几种针对癌细胞表面抗原的单克隆抗体已得到批准用于癌症治疗，例如利妥昔单抗用于非霍奇金淋巴瘤、曲妥珠单抗用于乳腺癌、西妥昔单抗用于头颈和结直肠癌、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitimumab)和贝伐单抗用于结直肠癌，以及阿仑珠单抗用于慢性淋巴细胞白血病(Strome本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备缀合物的方法，所述缀合物包含缀合于具有连接基团的细胞毒性化合物的细胞结合剂(CBA)，所述方法包括使修饰的细胞毒性化合物在pH约4至约9下与修饰的CBA反应，其中：a)修饰的CBA包含键合于CBA的双官能交联剂的残基，且所述残基包含连接基团和硫醇反应性基团；且b)所述修饰的细胞毒性化合物包含硫醇基团和由下式表示的基团：

【技术特征摘要】
2011.02.15 US 61/443,062;2011.02.15 US 61/443,092;1.一种用于制备缀合物的方法，所述缀合物包含缀合于具有连接基团的细胞毒性化合物的细胞结合剂(CBA)，所述方法包括使修饰的细胞毒性化合物在pH约4至约9下与修饰的CBA反应，其中：a)修饰的CBA包含键合于CBA的双官能交联剂的残基，且所述残基包含连接基团和硫醇反应性基团；且b)所述修饰的细胞毒性化合物包含硫醇基团和由下式表示的基团：其中：Y是离去基团，且是亚硫酸盐(HSO3、HSO2或与阳离子形成的HSO3-、SO32-或HSO2-的盐)，偏亚硫酸氢盐(H2S2O5或与阳离子形成的S2O52-的盐)，单、二、三和四硫代磷酸盐(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2或与阳离子形成的PO3S3-、PO2S23-、POS33-或PS43-的盐)，硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3，硫代硫酸盐(HS2O3或与阳离子形成的S2O32-的盐)，连二亚硫酸盐(HS2O4或与阳离子形成的S2O42-的盐)，二硫代磷酸盐(P(＝S)(ORk’)(S)(OH)或其与阳离子形成的盐)，异羟肟酸(Rk’C(＝O)NOH或与阳离子形成的盐)，甲醛次硫酸氢盐(HOCH2SO2-或与阳离子形成的HOCH2SO2-的盐，诸如HOCH2SO2-Na+)或其混合物，其中Ri是具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基且被选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H和-PO3H中的至少一个取代基取代；Ri可进一步被本文所述的烷基取代基任选取代；Rj是具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基；Rk’是具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，芳基，杂环基或杂芳基。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰的细胞毒性化合物通过使具有硫醇基的含有亚胺的细胞毒性化合物与亚胺反应剂反应而产生。3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在与所述修饰的CBA反应前纯化所述修饰的细胞毒性化合物。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中：(1)含有亚胺的细胞毒性化合物由下式中的一者或其药学上可接受的盐表示：(2)所述修饰的细胞毒性化合物由下式中的一者或其药学上可接受的盐表示：且，(3)所述缀合物的所述修饰的细胞毒性化合物和连接基团部分由下式中的一者表示：其中：X’选自-H，氨基保护基团，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，任选取代的具有6至18个碳原子的芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，以及任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；Y'选自-H、氧代基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，任选取代的6至18元芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，任选取代的具有1至6个杂原子的3至18元杂环；Rc是-H或具有1至4个碳原子的取代或未取代的直链或支链的烷基；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’各自独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-Rc，卤素，胍基[-NH(C＝NH)NH2]，-OR，-NR’R”，-NO2，-NCO，-NR’COR”，-SR，由-SOR’表示的亚砜，由-SO2R’表示的砜，磺酸盐-SO3-M+，硫酸盐-OSO3-M+，由-SO2NR’R”表示的磺酰胺，氰基，叠氮基，-COR’，-OCOR’，-OCONR’R”；每次出现时，R独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，任选取代的具有6至18个碳原子的芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，或任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；R’和R”各自独立地选自-H，-OH，-OR，-NHR，-NR2，-COR，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，和任选取代的具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3-18元杂环；n是1至24的整数；W选自C＝O、C＝S、CH2、BH、SO和SO2；R6是-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；Z和Z’独立地选自-(CH2)n’-、-(CH2)n’-CR7R8-(CH2)na’-、-(CH2)n’-NR9-(CH2)na’-、-(CH2)n’-O-(CH2)na’-和-(CH2)n’–S-(CH2)na’-；n’和na’相同或不同，且选自0、1、2和3；R7和R8相同或不同，且各自独立地选自-H，-OH，-SH，-COOH，-NHR’，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-，氨基酸，具有2至6个氨基酸的肽单元，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基；R9独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-；A和A’相同或不同，且独立地选自-O-、氧代(-C(＝O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-N(R5)-和-CRR’N(R5)-，每次出现时，R5独立地为-H或任选取代的具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基；D和D’相同或不同，且独立地不存在或选自任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，氨基酸，具有2至6个氨基酸的肽，和聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-；L不存在，或当存在时包含硫醇基，或是聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-，具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基或烯基，苯基，具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环或5至18元杂芳基环，其中所述烷基、烯基、苯基或杂环或杂芳基环任选被取代；其中，X’、Y’、R6、Rc、R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’、R4’、L(如通过任选取代的基团)中的至少一者键合于式(Ib’)或(IIb’)中的连接基团。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述修饰的CBA通过使所述CBA与双官能交联剂反应而制备，所述双官能交联剂包含所述硫醇反应性基团和与所述CBA反应性的基团，两者均键合于所述连接基团。6.根据权利要求5所述的方法，其中与CBA反应性的所述基团与CBA的氨基(诸如Lys侧链的氨基)或与CBA的硫醇基(诸如Cys侧链的硫醇基)反应。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述硫醇反应性基团选自马来酰亚胺、乙烯基吡啶、乙烯基砜、乙烯基磺酰胺、基于卤代乙酰基的基团和二硫基。8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述硫醇反应性基团是马来酰亚胺、卤代乙酰胺基或-SSRd，其中Rd是具有1至4个碳原子的直链或支链的烷基、苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基、2-硝基吡啶基、4-硝基吡啶基或3-羧基-4-硝基吡啶基。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述修饰的CBA是：10.一种用于制备缀合物的方法，所述缀合物包含缀合于具有连接基团的细胞毒性化合物的细胞结合剂(CBA)，所述方法包括使所述CBA与含有亚胺的细胞毒性化合物、亚胺反应剂和包含连接基团的双官能交联剂反应以形成所述缀合物。11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述CBA与含有亚胺的细胞毒性化合物和亚胺反应剂接触以形成第一混合物；且然后将所述第一混合物与所述双官能交联剂接触以形成所述缀合物。12.根据权利要求11所述的方法，其中在形成所述第一混合物之后立即将所述双官能交联剂与所述第一混合物接触。13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其进一步包括纯化所述缀合物。14.一种用于制备缀合物的方法，所述缀合物包含缀合于具有连接基团的细胞毒性化合物的细胞结合剂(CBA)，所述方法包括：a)将修饰的细胞毒性化合物与包含所述连接基团的双官能交联剂、与所述CBA反应性的基团(诸如硫醇基、马来酰亚胺基团、卤代乙酰胺基团或胺基)以及与所述修饰的细胞毒性化合物反应性的基团反应以形成共价键合于所述双官能交联剂残基的第二修饰的细胞毒性化合物，其中所述残基包括连接基团和与所述CBA反应性的基团；其中所述修饰的细胞毒性化合物由下式中的一者或其药学上可接受的盐表示：且，其中：Y是离去基团，且是亚硫酸盐(HSO3、HSO2或与阳离子形成的HSO3-、SO32-或HSO2-的盐)，偏亚硫酸氢盐(H2S2O5或与阳离子形成的S2O52-的盐)，单、二、三和四硫代磷酸盐(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2或与阳离子形成的PO3S3-、PO2S23-、POS33-或PS43-的盐)，硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3，硫代硫酸盐(HS2O3或与阳离子形成的S2O32-的盐)，连二亚硫酸盐(HS2O4或与阳离子形成的S2O42-的盐)，二硫代磷酸盐(P(＝S)(ORk’)(S)(OH)或其与阳离子形成的盐)，异羟肟酸(Rk’C(＝O)NOH或与阳离子形成的盐)，甲醛次硫酸氢盐(HOCH2SO2-或与阳离子形成的HOCH2SO2-的盐，诸如HOCH2SO2-Na+)或其混合物，其中Ri是具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基且被选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H和-PO3H中的至少一个取代基取代；Ri可进一步被本文所述的烷基取代基任选取代；Rj是具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基；Rk’是具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，芳基，杂环基或杂芳基；X’选自-H，氨基保护基团，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，任选取代的具有6至18个碳原子的芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，以及任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；Y'选自-H、氧代基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，任选取代的6至18元芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，任选取代的具有1至6个杂原子的3至18元杂环；Rc是-H或具有1至4个碳原子的取代或未取代的直链或支链的烷基；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’各自独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-Rc，卤素，胍基[-NH(C＝NH)NH2]，-OR，-NR’R”，-NO2，-NCO，-NR’COR”，-SR，由-SOR’表示的亚砜，由-SO2R’表示的砜，磺酸盐-SO3-M+，硫酸盐-OSO3-M+，由-SO2NR’R”表示的磺酰胺，氰基，叠氮基，-COR’，-OCOR’，-OCONR’R”；每次出现时，R独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，任选取代的具有6至18个碳原子的芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，或任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；R’和R”各自独立地选自-H，-OH，-OR，-NHR，-NR2，-COR，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，和任选取代的具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3-18元杂环；n是1至24的整数；W选自C＝O、C＝S、CH2、BH、SO和SO2；R6是-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；Z和Z’独立地选自-(CH2)n’-、-(CH2)n’-CR7R8-(CH2)na’-、-(CH2)n’-NR9-(CH2)na’-、-(CH2)n’-O-(CH2)na’-和-(CH2)n’–S-(CH2)na’-；n’和na’相同或不同，且选自0、1、2和3；R7和R8相同或不同，且各自独立地选自-H，-OH，-SH，-COOH，-NHR’，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-，氨基酸，具有2至6个氨基酸的肽单元，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基；R9独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-；A和A’相同或不同，且独立地选自-O-、氧代(-C(＝O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-N(R5)-和-CRR’N(R5)-，每次出现时，R5独立地为-H或任选取代的具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基；D和D’相同或不同，且独立地不存在或选自任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，氨基酸，具有2至6个氨基酸的肽，聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-；L不存在，或当存在时，包含硫醇基或为聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-，具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基或烯基，苯基，具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环或5至18元杂芳基环，其中烷基、烯基、苯基或杂环或杂芳基环任选被取代；且，b)使所述第二修饰细胞毒性化合物在pH约4至约9下通过与CBA反应性的基团与CBA反应以形成所述缀合物。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述与CBA反应性的基团是硫醇基、马来酰亚胺基、卤代乙酰胺基或胺基。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述修饰的细胞毒性化合物包含硫醇基，且与所述修饰的细胞毒性化合物反应性的基团是硫醇反应性基团。17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞毒性化合物通过使含有下式硫醇基的含有亚胺的细胞毒性化合物与亚胺反应剂在下述反应混合物中反应而产生：18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包含在步骤a)前纯化所述修饰的细胞毒性化合物。19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其进一步包含在步骤b)之前纯化所述第二修饰细胞毒性化合物。20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中在所述冻结的混合物解冻以及步骤a)实施前，将反应混合物冷冻贮藏。21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其进一步包括将冷冻的步骤a)解冻之前和步骤b)实施之前储存所述反应混合物。22.根据权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂是双马来酰亚胺己烷或BMPEO。23.根据权利要求2-22中任一项所述的方法，其中所述含有亚胺的细胞毒性化合物由下式中的任一者或其药学上可接受的盐表示：其中：X’选自-H，氨基保护基团，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，任选取代的具有6至18个碳原子的芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，以及任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；Y'选自-H、氧代基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，任选取代的6至18元芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，任选取代的具有1至6个杂原子的3至18元杂环；Rc是-H或具有1至4个碳原子的取代或未取代的直链或支链的烷基；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’各自独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-Rc，卤素，胍基[-NH(C＝NH)NH2]，-OR，-NR’R”，-NO2，-NCO，-NR’COR”，-SR，由-SOR’所表示的亚砜，由-SO2R’所表示的砜，磺酸盐-SO3-M+，硫酸盐-OSO3-M+，由-SO2NR’R”所表示的磺酰胺，氰基，叠氮基，-COR’，-OCOR’，-OCONR’R”和连接基团；每次出现时，R独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，任选取代的具有6至18个碳原子的芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，或任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；R’和R”各自独立地选自-H，-OH，-OR，-NHR，-NR2，-COR，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，和任选取代的具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3-18元杂环；n是1至24的整数；W选自C＝O、C＝S、CH2、BH、SO和SO2；R6是-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；Z和Z’独立地选自-(CH2)n’-、-(CH2)n’-CR7R8-(CH2)na’-、-(CH2)n’-NR9-(CH2)na’-、-(CH2)n’-O-(CH2)na’-和-(CH2)n’–S-(CH2)na’-；n’和na’相同或不同，且选自0、1、2和3；R7和R8相同或不同，且各自独立地选自-H，-OH，-SH，-COOH，-NHR’，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-，氨基酸，具有2至6个氨基酸的肽单元，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基；R9独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-；A和A’相同或不同，且独立地选自-O-、氧代(-C(＝O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-N(R5)-和-CRR’N(R5)-，每次出现时，R5独立地为-H或任选取代的具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基；D和D’相同或不同，且独立地不存在或选自任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，氨基酸，具有2至6个氨基酸的肽，和聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-；L不存在，或当存在时，包含硫醇基，且是聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-，具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基或烯基，苯基，具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环或5至18元杂芳基环，其中所述烷基、烯基、苯基或杂环或杂芳基环任选被取代。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述含有亚胺的细胞毒性化合物由下式中的任一者表示：其中：L’、L”和L”’相同或不同，且独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-Rc，卤素，胍基[-NH(C＝NH)NH2]，-OR，-NR’R”，-NO2，-NR’COR”，-SR，由-SOR’所表示的亚砜，由-SO2R’所表示的砜，磺酸盐-SO3M，硫酸盐-OSO3M，由-SO2NR’R”所表示的磺酰胺，氰基，叠氮基，-COR’，-OCOR’，-OCONR’R”；M是-H或药学上可接受的阳离子；且G选自-CH-或-N-。25.根据权利要求24所述的方法，所述修饰的细胞毒性化合物当存在时由下式中的一者或其药学上可接受的盐表示：26.根据权利要求23、24或25所述的方法，其中L’、L”或L”’中的一者具有硫醇基，而其它是-H。27.根据权利要求26所述的方法，其中L’具有硫醇基，而L”和L”’是-H。28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中A和A’均是-O-；R6是-OMe；且G是-CH-。29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述含有亚胺的细胞毒性化合物由下式中的任一者表示：其中：W’不存在，或当存在时，选自-CReRe’-、-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CH2-S-、-CH2O-、-CH2NRe-、-O-(C＝O)O-、-O-(C＝O)N(Re)-、-N(Re)-、-N(Re)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(Re)-、-N(Re)-C(＝O)O-、-N(C(＝O)Re)C(＝O)-、-N(C(＝O)Re)-、-(O-CH2-CH2)n-、-SS-或-C(＝O)-或氨基酸或具有2至8个氨基酸的肽；Rx不存在，或当存在时是任选被取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，具有6至10个碳原子的芳基，或具有1至3个选自O、N或S的杂原子的3至8元杂环；Re和Re’相同或不同，且选自-H，具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk是-H，具有1至6个碳原子的直链、支链的环状的烷基，任选地具有仲氨基(如，-NHR101)或叔氨基(-NR101R102)或5或6元含氮杂环，诸如哌啶或吗啉，其中R101和R102是各自独立地具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基；优选地，R101和R102是各自独立地具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基；n是1至24的整数。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述修饰的细胞毒性化合物当存在时由下式中的一者或其药学上可接受的盐表示：31.根据权利要求29或30所述的方法，其中：Y选自-SO3M、-SO2M或-OSO3M；M是-H或药学上可接受的阳离子诸如Na+或K+；X’选自-H，-OH，具有1至10个碳原子的取代或未取代的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，苯基，以及氨基保护基团；Y’选自-H，氧代基团，具有1至10个碳原子的取代或未取代的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基；A和A’选自-O-和-S-；W’不存在或选自-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(＝O)-、-N(C(＝O)Re)-、-S-或-CH2-S-、-CH2NRe-；Rx不存在或选自具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基；Re是-H，具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk是-H，具有1至6个碳原子的直链、支链环状的烷基，任选地具有仲氨基(如，-NHR101)或叔氨基(-NR101R102)基团或5或6元含氮杂环，如哌啶或吗啉，其中R101和R102各自独立地为具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基；G选自-CH-或-N-。32.根据权利要求29-31所述的方法，其中W’是-N(Re)-。33.根据权利要求32所述的方法，其中Re是-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk是-H，具有1至6个碳原子的直链、支链环状的烷基。34.根据权利要求33所述的方法，其中Rk是-H或-Me，n是4，且q是2。35.根据权利要求34所述的方法，其中Rx是具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基。36.根据权利要求34所述的方法，其中Rx是-(CH2)p-(CRfRg)-，其中Rf和Rg各自独立地选自-H或具有1至4个碳原子的直链或支链的烷基；且p是0、1、2或3。37.根据权利要求36所述的方法，其中Rf和Rg相同或不同，且选自-H和-Me；且p是1。38.根据权利要求29-37中任一项所述的方法，其中：Y是-SO3M、-SO2M或硫酸盐-OSO3M；优选为-SO3M；M是-H或药学上可接受的阳离子(如，Na+)；X’和Y’均是-H；A和A’均是-O-；R6是-OMe；且Rx是具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基。39.根据权利要求10-16和23-38中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂是：基于马来酰亚胺的部分，其选自：4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)、N-(对马来酰亚氨基苯基)异氰酸酯(PMPI)、N-琥珀酰亚胺基-4-(4-硝基吡啶基-2-二硫代)丁酸酯；或，基于卤代乙酰的部分，其选自：N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)，溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA)和3-(溴代乙酰氨基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)、双-马来酰亚胺聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N-(β-马来酰亚胺丙基氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、5-马来酰亚胺戊酸NHS、HBVS、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼·HCl(MPBH)、琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基磺酰基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代双-马来酰亚胺乙烷(DTME)、1,4-双-马来酰亚胺丁烷(BMB)、1,4-双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双-马来酰亚胺己烷(BMH)、双-马来酰亚胺乙烷(BMOE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SIAB)、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-马来酰亚胺丁基氧基)硫代琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、N-(ε-马来酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺酯(磺基-EMCS)、N-(κ-马来酰亚胺十一烷氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-KMUS)、4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMPB)、CX1-1、磺基-Mal和PEGn-Mal。40.根据权利要求23-38中任一项所述的方法，其中所述双官能交联剂选自SMCC、磺基-SMCC、BMPS、GMBS、SIA、SIAB、N-琥珀酰亚胺基-4-(4-硝基吡啶基-2-二硫代)丁酸酯、双-马来酰亚胺己烷或BMPEO。41.根据权利要求23-40中任一项所述的方法，其中所述修饰的CBA当存在时是：42.一种用于制备缀合物的方法，所述缀合物包含缀合于具有连接基团的细胞毒性化合物的细胞结合剂(CBA)，所述方法包括使第二修饰的细胞毒性化合物在pH约4至约9下与CBA反应，其中所述第二修饰的细胞毒性化合物包含：a)键合于所述细胞毒性化合物的双官能交联剂的残基，且所述残基包含连接基团和选自反应性酯和硫醇反应性基团的反应性基团，以及，b)由下式表示的基团：其中：Y是离去基团，且是亚硫酸盐(HSO3、HSO2或与阳离子形成的HSO3-、SO32-或HSO2-的盐)，偏亚硫酸氢盐(H2S2O5或与阳离子形成的S2O52-的盐)，单、二、三和四硫代磷酸盐(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2或与阳离子形成的PO3S3-、PO2S23-、POS33-或PS43-的盐)，硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3，硫代硫酸盐(HS2O3或与阳离子形成的S2O32-的盐)，连二亚硫酸盐(HS2O4或与阳离子形成的S2O42-的盐)，二硫代磷酸盐(P(＝S)(ORk’)(S)(OH)或其与阳离子形成的盐)，异羟肟酸(Rk’C(＝O)NOH或与阳离子形成的盐)，甲醛次硫酸氢盐(HOCH2SO2-或与阳离子形成的HOCH2SO2-的盐，诸如HOCH2SO2-Na+)或其混合物，其中Ri是具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基且被选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H和-PO3H中的至少一个取代基取代；Ri可进一步被本文所述的烷基取代基任选取代；Rj是具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基；Rk’是具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，芳基，杂环基或杂芳基。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第二修饰的细胞毒性化合物通过将亚胺反应剂与具有所述连接基团和所述反应性基团的含有亚胺的细胞毒性化合物反应而产生。44.根据权利要求42或43所述的方法，其进一步包括在与所述CBA反应之前纯化所述第二修饰的细胞毒性化合物。45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述反应性酯选自N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基酯、二硝基苯基酯、四氟苯基酯、磺基四氟苯基酯和五氟苯基酯。46.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述反应性酯是N-羟基琥珀酰亚胺酯。47.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述硫醇反应性基团选自马来酰亚胺、乙烯基吡啶、乙烯基砜、磺酰胺、基于卤代乙酰基和二硫基。48.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述硫醇反应性基团是马来酰亚胺、卤代乙酰胺基或-SSRd，其中Rd是具有1至4个碳原子的直链或支链的烷基，苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基、2-硝基吡啶基、4-硝基吡啶基或3-羧基-4-硝基吡啶基。49.根据权利要求14-48中任一项所述的方法，其中所述第二修饰的细胞毒性化合物由下式中的任一者表示：或其药学上可接受的盐表示，其中：Y是亚硫酸盐(HSO3、HSO2或与阳离子形成的HSO3-、SO32-或HSO2-的盐)，偏亚硫酸氢盐(H2S2O5或与阳离子形成的S2O52-的盐)，单、二、三和四硫代磷酸盐(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2或与阳离子形成的PO3S3-、PO2S23-、POS33-或PS43-的盐)，硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3，硫代硫酸盐(HS2O3或与阳离子形成的S2O32-的盐)，连二亚硫酸盐(HS2O4或与阳离子形成的S2O42-的盐)，二硫代磷酸盐(P(＝S)(ORk’)(S)(OH)或其与阳离子形成的盐)，异羟肟酸(Rk’C(＝O)NOH或与阳离子形成的盐)，甲醛次硫酸氢盐(HOCH2SO2-或与阳离子形成的HOCH2SO2-的盐，诸如HOCH2SO2-Na+)或其混合物，其中Ri是具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基且被选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H和-PO3H中的至少一个取代基取代；Ri可进一步被本文所述的烷基取代基任选取代；Rj是具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基；Rk’是具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，芳基，杂环基或杂芳基；X’选自-H，氨基保护基团，具有键合至其的反应性基团的连接基团，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，任选取代的具有6至18个碳原子的芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，和任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；Y’选自-H、氧代基团、具有键合至其的反应性基团的连接基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，任选取代的6至18元芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，任选取代的具有1至6个杂原子的3至18元杂环；Rc是-H或具有1至4个碳原子的取代或未取代的直链或支链的烷基，或具有键合至其的反应性基团的连接基团；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’各自独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-Rc，卤素，胍基[-NH(C＝NH)NH2]，-OR，-NR’R”，-NO2，-NCO，-NR’COR”，-SR，由-SOR’所表示的亚砜，由-SO2R’所表示的砜，磺酸盐-SO3-M+，硫酸盐-OSO3-M+，由-SO2NR’R”所表示的磺酰胺，氰基，叠氮基，-COR’，-OCOR’，-OCONR’R”和具有键合至其的反应性基团的连接基团；每次出现时，R独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，任选取代的具有6至18个碳原子的芳基，任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至18元杂芳基环，或任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；R’和R”各自独立地选自-H，-OH，-OR，-NHR，-NR2，-COR，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc，和任选取代的具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环；n是1至24的整数；W选自C＝O、C＝S、CH2、BH、SO和SO2；R6是-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2、卤素或具有键合至其的反应性基团的连接基团；Z和Z’独立地选自-(CH2)n’-、-(CH2)n’-CR7R8-(CH2)na’-、-(CH2)n’-NR9-(CH2)na’-、-(CH2)n’-O-(CH2)na’-和-(CH2)n’–S-(CH2)na’-；n’和na’相同或不同，且选自0、1、2和3；R7和R8相同或不同，且各自独立地选自-H，-OH，-SH，-COOH，-NHR’，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-，氨基酸，具有2至6个氨基酸的肽单元，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基；R9独立地选自-H，任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-；A和A’相同或不同，且独立地选自-O-、氧代(-C(＝O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5-和-CRR’N(R5)-；每次出现时，R5独立地为-H或任选取代的具有1至10个碳原子的直链或支链的烷基；D和D’相同或不同，且独立地不存在或选自任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，氨基酸，具有2至6个氨基酸的肽，聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-；L不存在，为具有键合至其的反应性基团的连接基团，聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-，具有1至10个碳原子的直链、支链或环状的烷基或烯基，苯基，具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3至18元杂环或5至18元杂芳基环，其中所述烷基、烯基为任选被具有键合至其的反应性基团的连接基团取代；苯基或杂环或杂芳基环可任选被取代，其中所述取代基可以是具有键合至其的反应性基团的连接基团。50.根据权利要求49所述的方法，其中L不存在，或选自任选取代的苯基和任选取代的吡啶基，其中所述苯基和吡啶基具有连接基团，所述连接基团具有键合至其的反应性基团，或L是具有连接基团的胺基(即，-N(连接基)-)，所述连接基团具有键合至其的反应性基团，或L是具有1至6个碳原子且具有连接基团的直链、支链或环状的烷基或烯基，所述连接基团具有键合至其的反应性基团。51.根据权利要求49所述的方法，其中键合于连接基团的所述细胞毒性化合物由下式中的任一者表示，所述连接基团具有连接至其的反应性基团：其中：L’、L”和L”’相同或不同，且独立地选自-H、具有1至10个碳原子的任选取代的直链、支链或环状的烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n-Rc，卤素，胍基[-NH(C＝NH)NH2]，-OR，-NR’R”，-NO2，-NR’COR”，-SR，由-SOR’表示的亚砜，由-SO2R’表示的砜，磺酸盐-SO3M，硫酸盐-OSO3M，由-SO2NR’R”表示的磺酰胺，氰基，叠氮基，-COR’，-OCOR’，-OCONR’R”和具有键合至其的反应性基团的连接基团，条件是L’、L”和L”’中仅一者是具有键合至其的反应性基团的连接基团；M是-H或药学上可接受的阳离子；且G选自-CH-或-N-。52.根据权利要求51所述的方法，其中L’、L”或L”’中的一者是具有键合至其的反应性基团的连接基团，而其它是-H。53.根据权利要求52所述的方法，其中L’是具有键合至其的反应性基团的连接基团，而L”和L”’均是-H。54.根据权利要求52或53所述的方法，其中A和A’均是-O-，R6是-OMe，且G是-CH-。55.根据权利要求52、53或54所述的方法，其中L’由下式表示：-W’-Rx-V-Ry-J，其中：W’和V相同或不同，且各自独立地不存在或选自-CReRe’-、-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CH2-S-、-CH2O-、-CH2NRe-、-O-(C＝O)O-、-O-(C＝O)N(Re)-、-N(Re)-、-N(Re)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(Re)-、-N(Re)-C(＝O)O-、-N(C(＝O)Re)C(＝O)-、-N(C(＝O)Re)-...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·菲什金，M·米勒，李为，R·辛格，
申请(专利权)人：伊缪诺金公司，
类型：发明
国别省市：美国,US