一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，该方法中初选培养基采用梵净山冷杉针叶、枯枝以及树皮作为碳源，制作的梵净山冷杉纤维素降解菌克服现有的维素降解菌污染率高、生长周期长、工艺复杂的问题，使得工艺简便、菌种纯、污染少、操作简单、周期短。本发明专利技术缩短了林地覆盖物降解周期，提高梵净山冷杉林土壤孔隙度10～12％，提高土壤团聚体5～8％，增加土壤含水量5～7％，降低土壤容重8％，降低生产成本20％，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。本发明专利技术的方法可实现梵净山冷杉纤维素降解菌的规模化、产业化生产，为贵州省特有物种‑梵净山冷杉的保育与扩繁提供一条新路。

A kind of Abies fanjingshanensis cellulose degrading bacteria screening method

The invention discloses a screening method of Abies fanjingshanensis cellulose degrading bacteria, the base of Abies fanjingshanensis needles, twigs and bark as the primary carbon source of the culture method, making the Abies fanjingshanensis cellulose degrading bacteria to overcome existing cellulose degrading bacteria contamination rate, growth cycle is long and complicated problem the process is simple, pure strain, less pollution, simple operation, short cycle. The invention can shorten the degradation period covering forest, Abies fanjingshanensis forests to improve the soil porosity of 10 ~ 12%, 5 ~ 8% increased soil aggregate, soil water content increase from 5 to 7%, soil bulk density decreased 8%, the production cost is reduced by 20%, to promote the propagation of Abies fanjingshanensis natural and natural more new. The industrialization of the production method of the invention can realize Abies fanjingshanensis cellulose degrading bacteria, and provide a new way for the conservation and breeding of Guizhou province endemic species Abies fanjingshanensis.

【技术实现步骤摘要】
一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法
本专利技术涉及一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，属于土壤改良

技术介绍
梵净山冷杉(Abiesfanjingshanensis)，国家一级保护植物，为中国贵州省特有种，亦为第四纪残遗植物。仅残存于梵净山的局部地段，分布区极其狭窄，数量稀少，加上结实率低，自然更新不良，需加以保护才不致灭绝。被列入《中国植物红皮书》并成为国家一级保护植物，全球重点保护的针叶树种。梵净山冷杉属阴性树种，耐荫性强，喜阴湿，常绿乔木，高22m，胸径65cm，冬芽卵球形，叶在小枝下面呈梳状，在上面密集，向外向上伸展，叶上有树脂道2个，边生或近边生，球果圆柱状长圆形，直立，成熟时深褐色，长5～6cm，直径约4cm，种子长卵圆形，微扁，种翅倒楔形，褐色或灰褐色，适宜于夏凉冬冷，雨量充沛亚热带季风山地气候，土壤为山地黄棕壤，较湿润肥沃，pH值4.5～6.5。耐荫性强，喜冷湿，一般多为纯林，也有混交林，通常5～6月开花，球果10～11月成熟。梵净山冷杉林在梵净山东北坡的亚高山暗针叶林中，常为片状集中分布，形成优势种群，由于冷杉具有较为稠密的林冠，针叶较为宽，树梢通直，树冠成塔形等特性。结实年龄在林缘约40～50年，结实周期4～5年，且球果出籽率少，采集的梵净山冷杉球果中种子的胚极少发育，多为空瘪的膜状物。在梵净山，由于林地覆盖物较厚，严重影响幼苗、幼树的生长与发育，林下虽有小苗，却极少见到小树，导致天然更新较差，幼苗长势弱。目前我国还未见梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，梵净山冷杉林地覆盖物清理主要依赖于自然降解辅以人工清理，严重影响梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新，使得梵净山冷杉林处于濒危灭绝的状态。因此筛选高效的梵净山冷杉纤维素降解菌，对改善梵净山冷杉林地生态环境，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新具有重要意义。
技术实现思路
为了克服现有的纤维素降解菌污染率高、生长周期长、工艺复杂的问题，提供一种梵净山冷杉纤维素降解菌筛选方法，使得制成的梵净山冷杉纤维素降解菌工艺简便、污染少、操作简单、周期短，极大改善梵净山冷杉林地生态环境，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。本专利技术的技术方案：一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，包括以下步骤：(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶50～80份、梵净山冷杉枯枝60～80份、梵净山冷杉树皮70～90份、胰蛋白胨6～8份、维生素B60.000025～0.000035份、磷酸氢二钾0.50～0.70份，氯化钠0.55～0.65份、硫酸镁0.50～0.60份、氯化钙0.55～0.65份、牛肉浸膏0.55～0.70份以及氯霉素0.008～0.010份加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶150～200份洗净以及切成块状的去皮马铃薯150～200份加入1000份水中，煮沸30～40min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖15～25g和琼脂15～20g，然后加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物20～30g放入初选培养基中；(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、110～130r/min的菌种培养摇床中培养6～8天；(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上25～30℃恒温培养24～36h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。上述方法中，所述的初选培养基采用含水量为30％～40％的梵净山冷杉针叶、枯枝以及树皮作为碳源，粗硬类的枯枝、树皮单独挑出，粉碎至2～5毫米，细软类的针叶粉碎至1～2厘米。因此，30％～40％的水份调控有利于树枝分解，更有利于纤维素变成小分子有机物而被微生物吸收；同时，粉碎枯枝以及针叶有利于机物微生物和含糖有机物充分接触，并产生更多空隙有利于微生物呼吸作用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术中的初选培养基采用梵净山冷杉针叶、枯枝以及树皮作为碳源，制作的梵净山冷杉纤维素降解菌克服现有的维素降解菌污染率高、生长周期长、工艺复杂的问题，使得工艺简便、菌种纯、污染少、操作简单、周期短。本专利技术缩短了林地覆盖物降解周期，提高梵净山冷杉林土壤孔隙度10～12％，提高土壤团聚体5～8％，增加土壤含水量5～7％，降低土壤容重8％，降低生产成本20％，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。本专利技术专利的方法可实现梵净山冷杉纤维素降解菌的规模化、产业化生产，为贵州省特有物种-梵净山冷杉的保育与扩繁提供一条新路。具体实施方式为了使本专利技术目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1本专利技术的一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，包括以下步骤：(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶50份、梵净山冷杉枯枝60份、梵净山冷杉树皮70份、胰蛋白胨6份、维生素B60.000025份、磷酸氢二钾0.50份，氯化钠0.55份、硫酸镁0.50份、氯化钙0.55份、牛肉浸膏0.55份以及氯霉素0.008份加水定容至1000份，控制pH值为5.0，在110℃下用压力为0.1Mpa的高压蒸汽灭菌25min，然后置于24℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶150份洗净以及切成块状的去皮马铃薯150份加入1000份水中，煮沸30min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖15g和琼脂15g，然后加水定容至1000份，控制pH值为5.0，在110℃下用压力为0.1Mpa的高压蒸汽灭菌25min，然后置于24℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物20g放入初选培养基中；(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、110r/min的菌种培养摇床中培养6天；(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上25℃恒温培养24h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。本专利技术缩短了林地覆盖物降解周期，提高梵净山冷杉林土壤孔隙度10％，提高土壤团聚体5％，增加土壤含水量5％，降低土壤容重8％，降低生产成本20％，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶50～80份、梵净山冷杉枯枝60～80份、梵净山冷杉树皮70～90份、胰蛋白胨6～8份、维生素B60.000025～0.000035份、磷酸氢二钾0.50～0.70份，氯化钠0.55～0.65份、硫酸镁0.50～0.60份、氯化钙0.55～0.65份、牛肉浸膏0.55～0.70份以及氯霉素0.008～0.010份加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶150～200份洗净以及切成块状的去皮马铃薯150～200份加入1000份水中，煮沸30～40min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖15～25g和琼脂15～20g，然后加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物20～30g放入初选培养基中；(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、110～130r/min的菌种培养摇床中培养6～8天；(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上25～30℃恒温培养24～36h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。...

【技术特征摘要】
1.一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶50～80份、梵净山冷杉枯枝60～80份、梵净山冷杉树皮70～90份、胰蛋白胨6～8份、维生素B60.000025～0.000035份、磷酸氢二钾0.50～0.70份，氯化钠0.55～0.65份、硫酸镁0.50～0.60份、氯化钙0.55～0.65份、牛肉浸膏0.55～0.70份以及氯霉素0.008～0.010份加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶150～200份洗净以及切成块状的去皮马铃薯150～200份加入1000份水中，煮沸30～40min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖15～25g和琼脂15～20g，然后加水定容至1000份，控制p...

【专利技术属性】
技术研发人员：张家春，张珍明，何云松，贺红早，刘盈盈，罗文敏，张玉武，
申请(专利权)人：贵州省植物园，
类型：发明
国别省市：贵州,52