粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种粪肠球菌的高密度发酵培养基及其发酵工艺，发酵培养基组分及其含量如下：甘油20～30g/L、豆粕10～15g/L、硫酸铵1～3g/L、三水合磷酸氢二钾2～3g/L、三水合乙酸钠3～8g/L、二水合柠檬酸钠2～4g/L、七水合硫酸镁0.3～0.8g/L、一水合硫酸锰0.1～0.3g/L。发酵工艺:采用高溶氧(25％)并结合甘油为碳源发酵,以碳酸钠恒定发酵液pH值5.5，并在发酵过程中流加补料控制甘油浓度在10g/L,培养16小时后OD(600nm)大于35标志发酵结束，发酵液含粪肠球菌活菌数可达8×10

【技术实现步骤摘要】
粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵工艺
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵工艺，适用于粪肠球菌的高密度发酵生产。
技术介绍
《饲料添加剂品种目录(2013)》将粪肠球菌规定为可以添加到饲料中的菌种，其在动物肠道内可形成生物薄膜附着于动物肠道粘膜上，并且发育、生长和繁殖。粪肠球菌属于人及动物肠道中的正常菌群，进入肠道后可有效定殖。粪肠球菌发酵产生乳酸，有利于降低肠道环境pH，抑制有害菌的生长。粪肠球菌代谢过程中还会产生过氧化氢，细菌素等物质，对致病菌有一定的杀灭作用，而且能产生天然抗生素，有利于机体健康，目前在养殖业中应用比较广泛，但传统的粪肠球菌发酵多选用MRS培养基，价格昂贵，发酵后的活菌数低，在益生菌有效使用剂量固定的情况下，低发酵水平等于变相的增加了成本。低成本的培养基，高效的可放大的发酵工艺对于推进益生菌发酵的产业化有重大指导及实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种比现有技术更加能有效发酵粪肠球菌获得高菌体生物量的粪肠球菌高密度发酵培养基。本专利技术的另一目的在于提供了一种采用上述粪肠球菌高密度发酵培养基，并在粪肠球菌发酵期间合理添加补料，从而能比现有技术获得更高生物量的粪肠球菌高密度发酵工艺。本专利技术的第三个目的在于提供上述粪肠球菌高密度发酵工艺在粪肠球菌发酵生产中的应用。本专利技术的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：本专利技术提供一种粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)高密度发酵培养基，该粪肠球菌高密度发酵的种子和发酵培养基为液体培养基，其组分及其含量如下：甘油20～30g/L、豆粕10～15g/L、硫酸铵1～3g/L、三水合磷酸氢二钾2～3g/L、三水合乙酸钠3～8g/L、二水合柠檬酸钠2～4g/L、七水合硫酸镁0.3～0.8g/L、一水合硫酸锰0.1～0.3g/L。本专利技术还提供了该粪肠球菌高密度发酵培养基的发酵工艺，主要步骤如下：(1)将冷冻保存的粪肠球菌甘油菌种划线于MRS琼脂培养基上，放置32～39℃培养箱中培养至长出单菌落；上述单菌落中挑取饱满的单菌落接种于MRS液体试管，32～39℃，50～200r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养8～10小时后作为种子液；(2)配制粪肠球菌高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100％；(3)以2％～8％的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中；(4)发酵参数设定为：温度32～39℃；转速50～300r/min；通气比0.5～1.0VVM，维持溶氧20～30％；发酵过程中维持发酵液pH值为4.5～7.0，当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂(氨水、KOH、NaOH、CaCO3或Na2CO3中的任一种)维持在设定值。连续补加料液(补料培养基：甘油800g/L和硫酸铵80g/L)，保持甘油浓度维持在10g/L左右；(5)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值大于35时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达8×1010CFU/mL以上的发酵液。其中，所述补加料液的主要组分及其含量为：甘油800g/L、硫酸铵80g/L。优选地，发酵参数中维持溶氧20～30％更利于粪肠球菌活的生长。优选地，发酵参数中pH值为4.5～7.0更利于粪肠球菌活的生长。本专利技术的高密度发酵培养基及其发酵工艺适用于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，但为达到最好的专利技术效果，优选适用于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CICC20419。粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CICC20419购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。本专利技术的粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵工艺具有以下优点：本专利技术优化了粪肠球菌高密度发酵培养基，通过高溶氧结合甘油为碳源，并在发酵过程中采用pH反馈控制和甘油硫酸铵耦合流加策略，降低了发酵液中乳酸浓度，从而解除乳酸的反馈抑制，使用本专利技术的高密度发酵培养基及其发酵工艺发酵的粪肠球菌，菌体密度较普通发酵显著提高，活菌数在8×1010CFU/mL以上，这是现有的技术难以达到的发酵标准，是现行采用分批补料发酵方式获得高密度发酵粪肠球菌活菌数的2.78倍；较普通MRS培养基分批补料发酵培养活菌数2.2×109CFU/mL，提高40倍以上，实现了粪肠球菌的高密度发酵；可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，从而降低生产成本、提高生产效率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术的实施例1中不同碳源对粪肠球菌高密度发酵的影响的柱状图。图2为本专利技术的实施例1中不同碳源对粪肠球菌高密度发酵产乳酸的影响的柱状图。图3为本专利技术的实施例2中不同pH对粪肠球菌高密度发酵的影响的柱状图。图4为本专利技术的实施例3中不同碱性pH中和剂对粪肠球菌高密度发酵的影响的柱状图。图5为本专利技术的实施例4中恒定溶氧对粪肠球菌高密度发酵的影响的柱状图。图6为本专利技术的实施例5甘油-硫酸铵耦合流加补料分批发酵试验中的柱状图。图7为本专利技术的实施例6中粪肠球菌高密度发酵及比较的折线图。具体实施方式下面结合附图1-7对本专利技术的优选实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。通过下列实施例将更具体的说明本专利技术，但是应理解所述实施例仅是为了说明本专利技术，而不是以任何方式限制本专利技术的范围。本实施例中，粪肠球菌来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC20419。实施例1利用不同碳源进行粪肠球菌高密度发酵发酵培养基：豆粕10g/L、硫酸铵2g/L、三水合磷酸氢二钾2g/L、三水合乙酸钠5g/L、二水合柠檬酸钠2g/L、七水合硫酸镁0.3g/L、一水合硫酸锰0.2g/L、甘油/葡萄糖/蔗糖/淀粉20g/L,用25％氨水调至pH7.0。种子液制备：将在﹣80℃保存的粪肠球菌甘油菌种划线于MRS(葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；柠檬酸氢二铵2g/L；乙酸钠5g/L；磷酸氢二钾2g/L；硫酸镁0.58g/L；硫酸锰0.25g/L)琼脂培养基上，放置32℃培养箱中培养至长出单菌落；挑取饱满的单菌落接入装有MRS液体试管，37℃，50r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于MRS液体培养基，37℃，100r/min震荡培养8小时后作为种子液。发酵罐发酵培养:标定溶氧电极，配制发酵罐培养基3L，加入5L发酵罐中121℃、15min高压灭菌待用。调节罐体温度至37℃，使用25％氨水调节pH至7.0，并接种种子液90ml，启动发酵程序。发酵参数设定为：温度37℃，初始转速150r/min；调节通气量和转速，维持的恒定溶氧分别为5％、10％、15％、20％；分析不同碳源(甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉)对粪肠球菌发酵罐发酵培养的影响。结果：如图1、图2所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粪肠球菌高密度发酵培养基，其特征在于，该粪肠球菌高密度发酵的种子和发酵培养基为液体培养基，其组分及其含量如下：甘油20～30g/L、豆粕10～15g/L、硫酸铵1～3g/L、三水合磷酸氢二钾2～3g/L、三水合乙酸钠3～8g/L、二水合柠檬酸钠2～4g/L、七水合硫酸镁0.3～0.8g/L、一水合硫酸锰0.1～0.3g/L。

【技术特征摘要】
1.一种粪肠球菌高密度发酵培养基，其特征在于，该粪肠球菌高密度发酵的种子和发酵培养基为液体培养基，其组分及其含量如下：甘油20～30g/L、豆粕10～15g/L、硫酸铵1～3g/L、三水合磷酸氢二钾2～3g/L、三水合乙酸钠3～8g/L、二水合柠檬酸钠2～4g/L、七水合硫酸镁0.3～0.8g/L、一水合硫酸锰0.1～0.3g/L。2.本发明提供权利要求1所述的粪肠球菌高密度发酵培养基的发酵工艺，主要步骤如下：(1)将冷冻保存的粪肠球菌甘油菌种划线于MRS琼脂培养基上，放置32～39℃培养箱中培养至长出单菌落；上述单菌落中挑取饱满的单菌落接种于MRS液体试管，32～39℃，50～200r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于MRS液体培养基，32～39℃，50～200r/min培养8～10小时后作为种子液；(2)配制粪肠球菌高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极；(3)以2％～8％的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁林，郭建军，曾静，杨罡，郭浩，王林庚，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所，江西鑫维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36