一种辣木的组织培养快繁方法技术

本发明专利技术提供一种辣木的组织培养快繁方法，通过辣木种子的消毒和萌发、不定芽诱导、继代增殖、生根培养，完成辣木的组织培养快繁。本发明专利技术通过器官繁殖方式进行辣木的快速增殖，不经过脱分化过程，避免了脱分化过程中引起的染色体变异，遗传稳定性高，且以芽繁芽的方式繁殖系数高，繁殖速度快，可以满足市场对于辣木苗的较高需求。本发明专利技术是在前人试验的基础上的开拓与创新，所采用的培养基类型及培养条件更加有利于辣木不定芽的诱导及增殖，也更加有利于进行工厂化操作。

Fast breeding method for Moringa tissue culture

The present invention provides a method for the tissue culture and rapid propagation, and through the disinfection of Moringa seed germination, adventitious bud induction, subculture, rooting culture, the complete tissue culture propagation. Rapid proliferation by way of the invention of reproductive organs of Moringa, without dedifferentiation, avoid the chromosome variation caused by the dedifferentiation process, high genetic stability and bud proliferation way high propagation coefficient, fast propagation speed, can meet the market demand for higher Moringa seedlings. The invention is of pioneering and innovation based on former experiment, the types of media and culture conditions more conducive to the induction and proliferation of adventitious buds, and more conducive to the factory operation.

【技术实现步骤摘要】
一种辣木的组织培养快繁方法
本专利技术涉及一种辣木的组织培养快繁方法，属于苗木培育

技术介绍
目前，国内关于辣木快速繁殖的文献还很少。黎国运等以当年生辣木实生苗顶芽、幼嫩侧芽为繁殖材料，采用芽器官离体培养快速繁殖，不经过愈伤组织获得大量丛生芽，壮苗生根，大田移栽获得成功，首次对辣木的组织培养技术进行了探索。2007年是对辣木组织培养技术研究较多的一年，马崇坚等采用实生种子萌发诱导无菌苗，通过愈伤组织发生途径，对辣木愈伤组织诱导、丛生芽的诱导及增殖、生根培养基的配方和移栽等问题进行了探讨。罗云霞等利用辣木种子产生不定芽的微繁殖，对辣木的种子消毒方法，以及不定芽诱导、增殖、生根培养基的配方和移栽基质进行了探讨。向素琼等对M.oleiferaLam.（辣木、印度传统辣木）和M.stenopetala(Bakerf.)Cufod.（非洲辣木）两种基因型的不同外植体材料进行了离体培养，筛选了最适外植体材料，并对愈伤组织诱导及不定芽分化的培养基条件进行了选择。向素琼等、张洁等还对秋水仙素对离体培养辣木多倍体的诱导进行了研究，获得了四倍体再生植株。此后，又有王洪峰等选用印度改良辣木的幼苗茎段、朱尾银选用选优树新长出的嫩芽经外植体消毒后，进行了不定芽初代诱导、继代培养、生根诱导和生根苗移植试验，并对微繁体系建立过程中继代苗的玻璃化、生根苗黄化及愈伤头过大、移栽过程中的管理等问题进行了讨论。对辣木组织培养较为系统的研究是2012年赵翠翠通过器官发生途径建立和优化了辣木组织培养再生体系，对辣木的组培快繁体系的建立和相关机理进行的研究。她所采用的原材料包括新鲜和储藏一年的种子、1-2年生的嫩枝，研究的内容包括：原材料的消毒；愈伤组织的诱导、形态、活力、生理生化；探讨不同外植体器官直接发生途径的培养条件；炼苗移栽等。利用组培技术对原材料的需求量较小，可以周年生产，不受季节限制，所获得的再生植株以几何倍数大量繁殖，后代遗传性状稳定、无病毒，能够保持亲本的优良性状，具有其他繁殖方式不可比拟的优越性。但对组培操作技术要求严格，随着继代周期增加，畸形苗发生率、玻璃化情况、褐变情况增加，且成本投入较大等等成为制约组培技术发展的瓶颈。利用组织培养技术对辣木进行快速繁殖，可节约繁殖材料，缩短繁殖周期，大量提供无性系幼苗，并且保持母本的优良性状，提高经济效益。以前有些学者对辣木组培技术进行了研究，但研究成果在辣木苗木生产上的应用尚不普遍，究其原因，现有组培研究中技术要求过于复杂、不具有普遍适用性、组培过程中遇到的问题还没有有效解决办法、再生植株成活率低等是主要的因素，辣木组培技术还有很大发展空间。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种辣木的组织培养快繁方法，利用生物技术结合常规育种方式来实现对优质辣木的种质资源进行保存，研究出辣木的组织培养生根配方，以解决现有技术的不足和难题。为实现上述目标，本专利技术采用的技术方案如下所示：一种辣木的组织培养快繁方法，经过下列各步骤：（1）辣木种子的消毒和萌发：去除外壳后立即在超净工作台上对已剥壳的种胚进行消毒处理，消毒处理的方法为先用75%酒精溶液振荡清洗30s，再在0.1%升汞溶液中振荡浸泡20min，最后用无菌水清洗6次；辣木种子的发芽温度为25~28℃；当种子萌发后大部分无菌苗长至3~4cm时，切去根及子叶，将上胚轴作为不定芽诱导的材料；（2）不定芽诱导：将步骤（1）所得上胚轴接种于不定芽诱导培养基中：MS+0.1~0.5mg/L6-BA+0.01~0.05mg/LNAA+20.0g/L蔗糖+2.75g/L琼脂，pH为5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照条件下进行培养以诱导不定芽发生，当诱导的丛芽或单芽生长到3~5cm时，切取生长较为一致、健康且不带或带少量愈伤的单芽；（3）继代增殖：将步骤（2）的单芽接种到继代增殖培养基：MS+0.1~0.5mg/L6-BA+0.01~0.05mg/LNAA+20.0g/L蔗糖+2.75g/L琼脂，pH为5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照条件下进行培养；（4）生根培养：将步骤（3）所得继代过1代，苗高2~5cm的培养物接种于生根培养基中：1/2MS+0.5mg/LIBA+0.1mg/LNAA+20.0g/L蔗糖+2.75g/L琼脂，pH为5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照条件进行生根培养，即完成辣木的组织培养快繁。本专利技术总结了国内外辣木研究进展情况，并在国内辣木组培技术研究的基础上，采用传统辣木改良种PKM-1的种子为材料，诱导萌发无菌苗，用其上胚轴作为不定芽诱导的外植体，并继代增殖，进行生根培养，对辣木组织培养过程中的关键技术进行了探讨。本专利技术的优点和创新性在于，利用辣木种子作为组织培养的原始材料，保持了种子的优良特性，对于辣木优良品种的选育具有重要意义。而通过器官繁殖方式进行辣木的快速增殖，可以不经过脱分化过程，避免了脱分化过程中引起的染色体变异，遗传稳定性高，且以芽繁芽的方式繁殖系数高，繁殖速度快，可以满足市场对于辣木苗的较高需求。本专利技术是在前人试验的基础上的开拓与创新，所采用的培养基类型及培养条件更加有利于辣木不定芽的诱导及增殖，也更加有利于进行工厂化操作。本专利技术与其他组培试验相比，在试验设置上更加具体、深入。在外植体的处理环节，本专利技术论证了去壳后立即消毒可以缩短消毒时间，减轻消毒剂对外植体的损害，提高无菌苗成活率，使试验操作更加简单快捷。在种胚发芽阶段特别设置了温度与培养基水分含量对种胚发芽影响的试验，是受种子发芽需要适宜的温度及充足的水分条件的概念的启发，并因此也找出了辣木种胚发芽所需要的温度及水分条件。在不定芽诱导阶段，本专利技术突出了细胞分裂素种类和浓度的选择以及细胞分裂素与生长素比例和浓度的配置这两个方面，在不定芽增殖阶段，本专利技术突出了无机盐浓度、细胞分裂素种类和浓度的选择、细胞分裂素与生长素比例和浓度及种类等几个方面，步步深入，最后寻找出了辣木不定芽诱导和增殖的最适培养基类型，并且论证了辣木不定芽诱导及增殖可以在同一种培养基上进行，简化了实验操作步骤，节约了实验材料。在不定芽生根阶段，本专利技术不仅记录了每组处理不定芽生根的数量，也对其起始生根所需要的时间及生根速度等也做出了比较，更加全面、更加具体地对辣木不定芽生根情况进行了分析。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1（1）辣木种子的消毒和萌发：去除外壳后立即在超净工作台上对已剥壳的种胚进行消毒处理，消毒处理的方法为先用75%酒精溶液振荡清洗30s，再在0.1%升汞溶液中振荡浸泡20min，最后用无菌水清洗6次；辣木种子的发芽温度为25~28℃；当种子萌发后大部分无菌苗长至3~4cm时，切去根及子叶，将上胚轴作为不定芽诱导的材料；（2）不定芽诱导：将步骤（1）所得上胚轴接种于不定芽诱导培养基中：MS+0.3mg/L6-BA+0.04mg/LNAA+20.0g/L蔗糖+2.75g/L琼脂，pH为5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照条件下进行培养以诱导不定芽发生，当诱导的丛芽或单芽生长到3~5cm时，切取生长较为一致、健康且不带或带少量愈伤的单芽；（3）继代增殖：将步骤（2）的单芽接种到继代增殖培养基：MS+0.4mg/L6-BA+0.03mg/LNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辣木的组织培养快繁方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）辣木种子的消毒和萌发：去除外壳后立即在超净工作台上对已剥壳的种胚进行消毒处理，消毒处理的方法为先用75%酒精溶液振荡清洗30s，再在0.1%升汞溶液中振荡浸泡20min，最后用无菌水清洗6次；辣木种子的发芽温度为25~28℃；当种子萌发后大部分无菌苗长至3~4cm时，切去根及子叶，将上胚轴作为不定芽诱导的材料；（2）不定芽诱导：将步骤（1）所得上胚轴接种于不定芽诱导培养基中：MS+0.1~0.5mg/L6‑BA+0.01~0.05mg/L NAA+20.0g/L蔗糖+2.75 g/L琼脂，pH为5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照条件下进行培养以诱导不定芽发生，当诱导的丛芽或单芽生长到3~5cm时，切取生长一致、健康且的单芽；（3）继代增殖：将步骤（2）的单芽接种到继代增殖培养基：MS+0.1~0.5 mg/L 6‑BA+0.01~0.05 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖+2.75 g/L琼脂，pH为5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照条件下进行培养；（4）生根培养：将步骤（3）所得继代过1代，苗高2~5cm的培养物接种于生根培养基中：1/2 MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖+2.75 g/L琼脂，pH为5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照条件进行生根培养，即完成辣木的组织培养快繁。...

【技术特征摘要】
1.一种辣木的组织培养快繁方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）辣木种子的消毒和萌发：去除外壳后立即在超净工作台上对已剥壳的种胚进行消毒处理，消毒处理的方法为先用75%酒精溶液振荡清洗30s，再在0.1%升汞溶液中振荡浸泡20min，最后用无菌水清洗6次；辣木种子的发芽温度为25~28℃；当种子萌发后大部分无菌苗长至3~4cm时，切去根及子叶，将上胚轴作为不定芽诱导的材料；（2）不定芽诱导：将步骤（1）所得上胚轴接种于不定芽诱导培养基中：MS+0.1~0.5mg/L6-BA+0.01~0.05mg/LNAA+20.0g/L蔗糖+2.75g/L琼脂，pH为5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵一鹤，吴义军，施蕊，张静美，夏菁，
申请(专利权)人：云南省林业科学院，
类型：发明
国别省市：云南,53