IL‑17抗体中半胱氨酸残基的选择性还原制造技术

本发明专利技术涉及选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的IL‑17抗体或其抗原结合片段制品(例如苏金单抗抗体制品)中的CysL97的方法。本发明专利技术还提供了通过这些方法生产的IL‑17抗体或其抗原结合片段的纯化制品，例如苏金单抗的纯化制品，其中该制品中的完整IL‑17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)的含量较高，例如通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE‑SDS)测得为至少约90％，并且其中该制品中的IL‑17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)的活性水平较高，例如通过阳离子交换色谱(CEX)测得为至少约92％。

Selective IL 17 cysteine residues in reducing antibody

The present invention relates to selective reduction in mammalian cells by recombinant IL 17 antibody or antigen binding fragment products (such as Su Kim monoclonal antibodies of CysL97 products). The invention also provides a purification product fragment produced by these methods IL 17 antibody or antigen binding, such as purification products Su Kim monoclonal antibodies, wherein the product of complete IL 17 antibody or antigen binding fragment (e.g. Su Kim mAb) were higher, for example by twelve sodium dodecyl sulfate capillary electrophoresis (CE SDS) measured at least about 90%, and the product of IL 17 antibody or antigen binding fragment (e.g. Su Kim mAb) activity level is higher, for example by cation exchange chromatography (CEX) was measured for at least about 92%.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】IL-17抗体中半胱氨酸残基的选择性还原相关申请本申请要求2014年12月22日提交的美国临时专利申请第62/095361号的优先权，其通过引用全文纳入。
本专利技术涉及在通过哺乳动物细胞以重组体方式生产的IL-17抗体及其抗原结合片段的制品(例如苏金单抗制品)中选择性还原CysL97的方法。技术背景经典抗体由分子量各约为25kD的两个轻链(L)和分子量各约50kD的两个重链(H)组成。轻链和重链通过二硫键(L-S-S-H)连接，两个LH单元还在重链之间通过两个二硫键连接。经典抗体的通式为L-SS-H(-SS-)2H-SS-L或简式H2L2(HHLL)。除了这些保守性链间二硫键以外，还有保守性链内二硫键。这两种二硫键对于抗体的稳定性和行为(例如亲和性)都很重要。一般来说，二硫键通过抗体链中保守性位置处的两个半胱氨酸残基(Cys-SH)产生，它们自发形成二硫键(Cys-S-S-Cys)。二硫键的形成由环境的氧化还原电势以及由特异于硫醇-二硫化物交换的酶的存在决定。内部二硫键(Cys-S-S-Cys)使得抗体的三维结构稳定化。还存在异常抗体，其包含参与抗原识别和结合的额外的游离半胱氨酸(即，不成对的半胱氨酸)。对于这些抗体，游离半胱氨酸的改性会对该分子的活性和稳定性产生负面影响，并会导致提高的免疫原性。结果是难以处理这些抗体，因为最终产物可能包含显著量的惰性、错误折叠且无用的抗体材料。通过引用全文纳入的US20090280131提供了IL-17抗体，例如苏金单抗(即，AIN457)，其在轻链互补决定区(CDR)3环(L-CDR3)中顺-脯氨酸之后存在游离半胱氨酸(即，SEQIDNO:6所示L-CDR3的氨基酸8，其对应于SEQIDNO:10所示轻链可变区的氨基酸97，后文称为“CysL97”)。为了保持完全活性，苏金单抗的不成对的半胱氨酸残基不能通过与其他半胱氨酸残基的氧化性二硫配对或通过与外源化合物的氧化(例如，与其他蛋白质形成混合的二硫键，与细胞代谢产物[例如半胱氨酸或谷胱甘肽]发生衍生作用，以及通过氧气形成亚砜)而被掩蔽。不幸的是，由于苏金单抗是使用哺乳动物细胞制造的，的确会发生不利的基于细胞的CysL97改性。该文献描述了在细菌细胞中表达的哺乳动物蛋白质的再折叠，其产生作为具有混合二硫键的未折叠不溶性聚集体(包含体)的哺乳动物蛋白质。为了从细菌获得哺乳动物蛋白质，要用强离液剂和还原剂对包含体蛋白质进行分离、溶解和变性。使用变性剂、还原剂、二硫加合物形成剂和温和的氧化/还原环境(pH7-9)的完全变性与还原二硫键也已用来正确地再折叠得自商业来源或在酵母中重组产生的植物蛋白质(US4766205)。这些采用蛋白质的完全变性和再折叠的工艺昂贵、苛性、耗时，且对于在哺乳动物细胞中产生的蛋白质是不必要的。已知使用还原/氧化偶联剂来纠正非自然产生的Fc融合蛋白的错误折叠(WO02/68455)。据推测WO02/68455的Fc融合蛋白在Fc区域中包含链间二硫键，其通过所揭示的工艺被还原并被再氧化，但其中没有指出如何生产具有被选择性还原的半胱氨酸残基的分子。而且，Fc融合蛋白显然并非抗体，抗体是高度复杂的免疫球蛋白，其结构和活性依赖于无数正确连接的链间和链内二硫键。US20050123532提供了通过用还原剂活化抗体、或通过在补充有L-半胱氨酸的无血清培养基中培育抗体产生细胞来生产具有游离半胱氨酸的抗体的方法。使用这种细胞培育方法时，之后的处理步骤例如过滤、病毒灭活和色谱法会导致通过细胞培育方法生产的游离半胱氨酸发生氧化。在这种情况中，通过用氧化剂改性游离的硫醇基团使之后步骤过程中游离半胱氨酸理想地得到保护，之后采用各种技术例如过滤除去该氧化剂(US20060257393)。对于商业生产，这种方法在原始培育培养基中需要大量还原剂，在之后处理过程中需要大量氧化剂，并且需要额外的过滤方法来除去氧化剂，增加了生产消耗的时间以及费用。美国专利第7928205号提出了优先使用氧化还原对来再折叠得自哺乳动物细胞培育的IgG2抗体，以及使146B7(IgG1)抗体的可变区中的游离半胱氨酸脱半胱氨酰基化(decysteinylation)的方法。相应的研究出版物：Banks等的《药物科学杂志》(J.PharmaceuticalSci.)97:764-779(2008)指出了对重组单克隆IgG1抗体(MAB007)的可变区中的不成对巯基的脱半胱氨酰基化。Banks等研究了MAB007的脱半胱氨酰基化是否需要使用强变性剂(GdnHCL)和还原剂(半胱氨酸)，或是否能在仅存在半胱氨酸时发生选择性还原。这些作者确定，在存在和不存在变性剂的情况下有效地从MAB007中除去了半胱氨酰基。以上参考文献都没有指出是否能在苏金单抗中选择性还原CysL97。以上参考文献也没有指出在苏金单抗中选择性还原CysL97所需的试剂和条件，其取决于苏金单抗的一级、二级和三级结构；苏金单抗中被氧化的CysL97的位置和场所(例如溶剂可接近的或不可接近的)；以及抗体中保守性二硫键的相对强度(例如CysL97是否首先与给定的还原剂反应，或只有在保守性半胱氨酸被还原之后再反应)等等。而且，这些参考文献都未描述苏金单抗中被氧化的CysL97的选择性还原是否会导致改变抗体结构(例如折叠)、化学组成(例如脱酰氨基化)、或性质(结合活性、聚集或降解倾向)，所有这些都使得商业规模地选择性还原苏金单抗在技术上是不可行/不现实的。专利技术概述为了保持最大的苏金单抗抗原结合活性，专利技术人确定需要在处理苏金单抗过程中将CysL97从被掩蔽的式(1)转化成游离的式(2)形式(见以下I)而不明显还原保守性二硫键；否则就会因链脱连接而形成较低活性和非活性的较低分子量变体(H2L2→H2L，HL2，HL，H和L)。(I)H2L2-Cys-SX+试剂→H2L2-Cys-SH+X-试剂(1)(2)在商业规模的抗体制备过程中引入还原条件是违反直觉的(参见例如Trexler-Schmidt等，《生物技术和生物工程》(BiotechandBioengineering)106:452-61(2010)，其采用各种试剂和方法来防止抗体的细胞培育制造过程中的抗体二硫键还原)。尽管如此，专利技术人确定可以在哺乳动物细胞中的大规模商业生产过程中选择性还原苏金单抗中的CysL97而无抗体的明显变性。本专利技术揭示了在US20090280131中所揭示IL-17抗体(及其片段)、具体是苏金单抗的抗原结合位中选择性还原CysL97的方法。这些方法有助于恢复这些抗体的结合活性，并从而增加其制品的生物活性。而且，这些方法有助于增加完整抗体的含量，并提高这些抗体制品的同质性。所揭示的工艺倚赖于:孵育过程中体系中抗体:还原剂的具体比值以及受控传氧速率的组合效果。因此，本专利技术揭示了在通过哺乳动物细胞重组生产的IL-17抗体制品中选择性还原CysL97的方法，其包括:a)使该制品在体系中接触至少一种还原剂以形成还原混合物:和b)孵育该还原混合物同时保持该体系中的体积氧传质系数(kLa*)小于等于约0.37h-1，所述kLa*通过将溶解氧曲线适配至饱和曲线而算得；其中IL-17抗体各自包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的IL‑17抗体制品中的CysL97的方法，其包括：c)使该制品与至少一种还原剂在某体系中接触以形成还原混合物；和d)孵育该还原混合物同时保持该体系中的体积氧传质系数(kLa

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.22 US 62/095,3611.一种用于选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的IL-17抗体制品中的CysL97的方法，其包括：c)使该制品与至少一种还原剂在某体系中接触以形成还原混合物；和d)孵育该还原混合物同时保持该体系中的体积氧传质系数(kLa*)≤0.37h-1，所述kLa*通过将溶解氧曲线匹配至饱和曲线而算得；其中该IL-17抗体各自包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该VH包含如SEQIDNO:8所示VH的三个互补决定区(CDR)，该VL包含如SEQIDNO:10所示VL的三个CDR；并且其中在步骤a)之前，使用在25℃校准的氧探针测得，该制品中的初始氧饱和百分比至少为约60％。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种还原剂选自半胱胺、半胱氨酸及其组合。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种还原剂是含硫醇的还原剂，通过硫醇-二硫化物交换测得，其在pH7.0时的标准氧化还原电势E0为约-0.20V至约-0.23V。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述至少一种还原剂是半胱氨酸。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤b)期间该体系中的kLa*≤约0.37h-1，其中该还原混合物中的半胱氨酸:IL-17抗体摩尔比在约56:1至约118:1之间，并且其中该还原混合物按照步骤b)孵育至多约240分钟。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤b)期间该体系中的kLa*≤约0.37h-1，其中该还原混合物中的半胱氨酸:IL-17抗体摩尔比在约77:1至约118:1之间，并且其中该还原混合物按照步骤b)孵育至多约300分钟。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤b)期间该体系中的kLa*＜约0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:IL-17抗体摩尔比在约46:1至约118:1之间。8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤b)期间该体系中的kLa*＜约0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:IL-17抗体摩尔比在约54:1至约82:1之间。9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该还原混合物中的半胱氨酸:IL-17抗体摩尔比为约66:1。10.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤b)期间该体系中的kLa*≤约0.27h-1，优选≤约0.18h-1。11.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤a)之前，该制品包含约4mg/ml至约19.4mg/ml、例如约10mg/mg至约19.4mg/ml、例如约10mg/ml至约15.4mg/ml、例如约12mg/ml至约15mg/ml、例如约13.5mg/ml的IL-17抗体。12.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述还原混合物中的半胱氨酸浓度为约4.0mM至约8.0mM，例如约4.8mM至约8.0mM，例如约5.5mM至约6.7mM，例如约6.0mM。13.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤a)之前，该制品的pH为约7.3至约8.5，例如约7.8至约8.2，例如约7.9至约8.1，例如约8.0。14.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤a)之前，使用在25℃校准的氧探针测得，该制品中的初始氧饱和百分比为至少约80％或至少约60％。15.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述还原混合物还包含EDTA，并且其中该还原混合物中的EDTA浓度为约1.3mM至约0.8mM，例如约1.1至约0.9mM，例如约1.0mM。16.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤a)和步骤b)之间，将还原混合物加热到约32℃至约42℃之间、例如约35℃至约39℃之间、例如约37℃的温度。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，将所述还原混合物加热约45至约90分钟，例如约45至约75分钟，例如约60分钟。18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在加热期间该体系中的kLa*≤约0.69h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得。19.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，按照步骤b)在约20℃至约42℃之间、例如约32℃至约42℃、例如约35℃至约39℃、例如约37℃的温度下孵育该还原混合物。20.如权利要求7所述的方法，其特征在于，按照步骤b)将该还原混合物孵育约210至约420分钟，例如约210至约330分钟，例如约240至约300分钟，例如约250分钟。21.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤b)期间将该还原混合物搅拌≤约15分钟每小时，例如≤约5分钟每小时，例如≤约2分钟每小时。22.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤a)之后，通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)测得，该还原混合物中完整IL-17抗体的含量降低到至少约80％。23.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，其还包括：c)将从步骤b)得到的混合物冷却至室温，例如约16℃至约28℃之间。24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，按照步骤c)将该混合物冷却约45至约90分钟，例如约45至约75分钟，例如约60分钟。25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，在步骤c)期间该体系中的kLa*≤0.69h-1，所述kL...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·黑兹曼，J·温克勒，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH