突变的免疫球蛋白‑结合多肽制造技术

一种具有改进的碱稳定性的Fc‑结合多肽，其包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的Fc‑结合结构域的突变体，所述突变体由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO 51或EQ ID NO 52定义，其中至少在对应于SEQ ID NO:4‑7中11位的位置的天冬酰胺或丝氨酸残基已经突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。

Mutation of immunoglobulin binding peptide

A kind of improved Fc alkalistable binding peptide, which contains staphylococcal protein A (SpA) Fc binding domain mutants, the mutant by SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ NO:3, SEQ ID ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ NO:6, SEQ ID ID NO:7, SEQ NO:22, SEQ ID ID NO 51 or EQ NO 52 ID definition, at least in asparagine or serine residues corresponding to the SEQ ID NO:4 11 position in 7 has been selected from the mutant glutamic acid, lysine, threonine, tyrosine, phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan, methionine, valine, alanine, histidine and arginine amino acids.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变的免疫球蛋白-结合多肽
本专利技术涉及亲和色谱的领域，且更特别地涉及蛋白A的突变的免疫球蛋白-结合结构域，其可用于免疫球蛋白的亲和色谱。本专利技术还涉及突变的结构域的多聚体和涉及含有突变的结构域或多聚体的分离基质。专利技术背景免疫球蛋白代表全世界生产或开发的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求以及由此的价值已导致重点放在制药公司上，以使它们各自的mAb生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。亲和色谱在大多数情况下作为这些免疫球蛋白分子，例如单克隆或多克隆抗体的纯化中的关键步骤之一而使用。一类特别感兴趣的亲和试剂是能够特异性结合免疫球蛋白分子的不变部分的蛋白，这样的相互作用是独立于抗体的抗原-结合特异性的。这样的试剂可广泛用来从不同的样本(例如但不限于血清或血浆制备物或细胞培养物来源的原料)亲和色谱回收免疫球蛋白。这样的蛋白的例子是葡萄球菌蛋白A，其含有能够结合来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的结构域。这些结构域通常被称为E-、D-、A-、B-和C-结构域。基于葡萄球菌蛋白A(SpA)的试剂由于它们的高亲和性和选择性，已发现广泛用于生物
，例如用于抗体的捕获和纯化的亲和色谱以及用于检测或定量。目前，基于SpA的亲和介质很可能是最广泛使用的从不同的样本(包括工业细胞培养上清液)分离单克隆抗体及其片段的亲和介质。因此，包含蛋白A-配体的各种基质是可市售获得的，例如，以天然蛋白A的形式(例如蛋白ASEPHAROSE™,GEHealthcare,Uppsala,Sweden)，并且还包含重组蛋白A(例如rProteinASEPHAROSE™,GEHealthcare)。更特别地，在商业重组蛋白A产品中进行的基因操纵旨在促进其附接于支持体并提高配体的生产力。这些应用，像其它亲和色谱应用，需要综合考虑污染物的确切去除。这样的污染物可以例如是在色谱程序中吸附在固定相或基质上的未洗脱的分子，例如非-希望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质除去这样的污染物通常在第一次洗脱所需产物后进行，以在随后使用之前使基质再生。这样的除去通常涉及称为原位清洁(CIP)的程序，其中能够从固定相洗脱污染物的试剂被使用。经常使用的一类这样的试剂是通过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洁和消毒剂是NaOH，且其浓度可在从0.1至最多例如1M的范围内，这取决于污染的程度和性质。这个策略与基质暴露于具有13以上的pH-值的溶液有关。对于许多含有蛋白质亲和配体的亲和色谱基质，这样的碱性环境是非常苛刻的条件且随后由于配体对所涉及的高pH的不稳定性，导致能力下降。因此，广泛的研究已经集中于工程改造的蛋白配体的开发，所述配体表现出改进的耐碱性pH-值的能力。例如，Gülich等(SusanneGülich,MartinLinhult,Per-ÅkeNygren,MathiasUhlén,SophiaHober,JournalofBiotechnology80(2000),169-178)提出经工程改造以改进链球菌白蛋白-结合结构域(ABD)在碱性环境中的稳定性特性的蛋白。Gülich等创建一种ABD突变体，其中所有4个天冬酰胺残基已被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)替代。此外，Gülich等报告他们的突变体表现出一种类似于天然蛋白的靶蛋白结合行为，并且含有工程改造的配体的亲和柱在重复暴露于碱性条件后显示出比使用亲本的非-工程改造的配体制备的柱更高的结合能力。因此，从中得出结论，所有4个天冬酰胺残基可被替代，而对结构和功能无任何显著的影响。最近的工作显示，也可对蛋白A(SpA)进行修改以实现类似的特性。美国专利申请公布US2005/0143566，其通过引用以其整体结合到本文中，公开当至少一个天冬酰胺残基被突变为并非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，该突变赋予在至多约13-14的pH-值时，与亲本SpA，例如SpA的B-结构域，或蛋白Z(一种源自SpA的B-结构域的合成构建体)相比，增加的化学稳定性(US5,143,844，通过引用以其整体结合在此)。作者显示当这些突变的蛋白用作亲和配体时，分离介质如所期望的可更好地耐受使用碱性试剂的清洁程序。为增加碱稳定性目的，蛋白A结构域的另外的突变还已经公开于WO2008/039141、JP2006304633A、EP1992692A1,EP2202310A2、WO2010/110288、WO2012/086660、WO2012/083425、WO2012/087230和WO2014/146350中，其全部通过引用以其整体结合到本文中。然而，目前可获得的突变体仍然是对碱性pH敏感的，并且在清洁期间的NaOH浓度通常被限制在0.1M，这意味着完全的清洁难以实现。较高的NaOH浓度(这将改进清洁)导致不可接受的能力丧失。因此，本领域仍有获得含有蛋白配体的分离基质的需要，所述蛋白配体具有对碱性清洁程序的进一步改进的稳定性。专利技术概述本专利技术的一个方面是提供具有改进的碱稳定性的多肽。这用如在权利要求1中定义的多肽实现。一个优点是碱稳定性比亲本多肽有改进，并维持对免疫球蛋白和其它含有Fc的蛋白的高选择性结合。本专利技术的第二个方面是提供具有改进的碱稳定性的多聚体，其包含多个多肽。这用如在权利要求中定义的多聚体实现。本专利技术的第三个方面是提供编码具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的核酸或载体。这用如在权利要求中定义的核酸或载体实现。本专利技术的第四个方面是提供能够表达具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的表达系统。这用如在权利要求中定义的表达系统实现。本专利技术的第五个方面是提供能够选择性地结合免疫球蛋白和其它含有Fc的蛋白并表现出改进的碱稳定性的分离基质。这用如在权利要求中定义的分离基质实现。本专利技术的第六个方面是提供一种分离免疫球蛋白或其它含有Fc的蛋白的有效和经济的方法。这用如在权利要求中定义的方法实现。本专利技术的更合适的实施方案在从属权利要求中描述。定义术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并被理解为也包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。术语“Fc-结合多肽”和“Fc-结合蛋白”分别指能够结合抗体的可结晶部分(Fc)的多肽或蛋白并包括例如蛋白A和蛋白G，或维持所述结合特性的其任何片段或融合蛋白。术语“接头”在本文中意指使多聚体中的两个多肽单位，单体或结构域彼此连接的元件。术语“间隔区”在本文中指将多肽或多肽多聚体连接于支持体的元件。附图简述图1显示如由SEQIDNO:1-7和51-52定义的Fc-结合结构域的比对。图2显示来自实施例2的、对于偶联于SPR生物传感器芯片的亲本和突变的四聚体Zvar(SEQIDNO7)多肽变体的碱稳定性的结果。图3显示来自实施例4的、对于偶联于琼脂糖珠的亲本和突变的四聚体Zvar(SEQIDNO7)多肽变体的碱稳定性(0.5MNaOH)的结果。图4显示来自实施例4的、对于偶联于琼脂糖珠的亲本和突变的四聚体Zvar(SEQIDNO7)多肽变体的碱稳定性(1.0MNaOH)的结果。实施方案的详细描述一方面，本专利技术公开一种Fc-结合多肽，其包含葡萄球菌蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的Fc‑结合结构域的突变体的Fc‑结合多肽，所述突变体由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO 51或SEQ ID NO 52定义，或与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO 51或SEQ ID NO 52具有至少90%例如至少95%或98%的同一性，其中至少在对应于SEQ ID NO:4‑7中11位的位置的天冬酰胺或丝氨酸残基已经突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.12 GB 1510261.9;2015.06.12 GB 1510263.5;201.一种包含葡萄球菌蛋白A(SpA)的Fc-结合结构域的突变体的Fc-结合多肽，所述突变体由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:22、SEQIDNO51或SEQIDNO52定义，或与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:22、SEQIDNO51或SEQIDNO52具有至少90%例如至少95%或98%的同一性，其中至少在对应于SEQIDNO:4-7中11位的位置的天冬酰胺或丝氨酸残基已经突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。2.权利要求1的多肽，其包含葡萄球菌蛋白A(SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体，所述突变体由SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO51或SEQIDNO52定义，或与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO51或SEQIDNO52具有至少90%例如至少95%或98%的同一性。3.权利要求1或2的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中11位的位置的氨基酸残基是谷氨酸。4.任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中11位的位置的氨基酸残基是赖氨酸。5.任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中9位的位置的氨基酸残基是丙氨酸。6.任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中50位的位置的氨基酸残基是精氨酸或谷氨酸，例如精氨酸。7.任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中3位的位置的氨基酸残基是丙氨酸和/或对应于SEQIDNO:4-7中6位的位置的氨基酸残基是天冬氨酸。8.权利要求1-6的任一项的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7的3和6位的位置的至少一个，例如两个氨基酸残基是天冬酰胺。9.任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中43位的位置的氨基酸残基是丙氨酸或谷氨酸，例如丙氨酸。10.任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中28位的位置的氨基酸残基是丙氨酸或天冬酰胺。11.任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中40位的位置的氨基酸残基选自天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和缬氨酸。12.依据任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中42位的位置的氨基酸残基是丙氨酸、赖氨酸或精氨酸，例如精氨酸。13.依据任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中44位的位置的氨基酸残基是亮氨酸或异亮氨酸，例如异亮氨酸。14.依据任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中18位的位置的氨基酸残基是赖氨酸或组氨酸，例如赖氨酸。15.依据任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中33位的位置的氨基酸残基是赖氨酸或丝氨酸，例如赖氨酸。16.依据任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中37位的位置的氨基酸残基是谷氨酸或天冬氨酸，例如谷氨酸。17.依据任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7中51位的位置的氨基酸残基是酪氨酸或亮氨酸，例如酪氨酸。18.依据任一项前述权利要求的多肽，其中在对应于SEQIDNO:4-7的1、2、3和4位或对应于SEQIDNO:4-7的3、4、5和6位的位置的氨基酸残基已经缺失。19.依据任一项前述权利要求的多肽，其是由SEQIDNO:7定义的Zvar的突变体，其中在9位的氨基酸残基是丙氨酸和11位的氨基酸残基是赖氨酸或谷氨酸，例如赖氨酸。20.依据权利要求19的多肽，其中在43位的氨基酸残基是丙氨酸或谷氨酸。21.依据权利要求19或20的多肽，其中在40位的氨基酸残基是缬氨酸。22.依据权利要求19-21的任一项的多肽，其中在44位的氨基酸残基是异亮氨酸。23.依据任一项前述权利要求的多肽，其中所述突变选自：N11K；N11E；N11Y；N11T；N11F；N11L；N11W；N11I；N11M；N11V；N11A；N11H；N11R；N11E,Q32A；N11E,Q32E,Q40E；N11E,Q32E,K50R；Q9A,N11E,N43A；Q9A,N11E,N28A,N43A；Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I；Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I；N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y；Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I；Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y；N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I；Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I；Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R；Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R；Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I和Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I。24.依据权利要求1-22的任一项的多肽，其中所述突变选自：N11K；N11Y；N11F；N11L；N11W；N11I；N11M；N11V；N11A；N11H；N11R；Q9A,N11E,N43A；Q9A,N11E,N28A,N43A；Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I；Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I；Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I；N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I...

【专利技术属性】
技术研发人员：G罗德里戈，T布乔克曼，M安德，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE