靶定的免疫原制造技术

本发明专利技术提供了用于产生和利用靶定的免疫原的试剂和方法。在优选实施方案中，将免疫原缀合到将该免疫原靶向ＭＨＣ呈递途径的氨基酸序列。使用本文提供的试剂和方法，可以增强免疫方案，从而导致增加的宿主免疫性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于改进免疫方案的试剂和方法。例如，将免疫原性氨基酸序列导向MHC呈递途径的氨基酸序列。
技术介绍
尽管基于肽的疫苗有许多优点(安全、易于生产)，但是它们显示出有限的免疫原性。这部分是由于外源肽不能有效进入I类MHC呈递途径。从而，可以增强肽向MHC递送的策略具有增加基于肽的疫苗的功效的潜力。一种策略是将免疫原性序列连接到“蛋白质转导结构域”(PTD)，已经表明所述结构域驱动蛋白质和肽越过细胞膜的转运。示例性PTD包括HIT-Tat、细胞穿透肽(CPP)、Trojan载体、触角足同源域和人period-1蛋白。在一种方法中，抗原性肽附着到来自HIV-1 tat的短阳离子肽(即，残基49-57)以形成融合缀合物。已经表明抗原呈递细胞(“APC”)，如树突细胞的暴露可加工ova-tat缀合物，从而导致抗原特异的CD8+T细胞的刺激(Kim，等人J Immunol 1997 Aug 15；159(4)1666-8；Shibagaki，等人J Immunol 2002 Mar 1；168(5)2393-401)。这也已经对人黑素瘤抗原TRP2得到了证明(Wang，等人J Clin Invest 2002 Jun；109(11)1463-70)。将tat肽缀合到全长蛋白质后证明了相反的证据(Leifert，等人Gene Ther2002 Nov；9(21)1422-8)。在另一方法中，将触角足同源域(AntpHD)与CTL表位融合并且表明其增强了CD8+T细胞反应性(Chikh，等人J Immunol 2001Dec 1；167(11)6462-70；Pietersz，等人Vaccine 2001 Jan 8；19(11-12)1397-405；Schutze-Redelmeier，等人J Immunol 1996 Jul15；157(2)650-5)。已经表明可以使用具有最多达50个氨基酸的抗原性序列的AntpHD。在其他研究中，已经表明来自人period-1蛋白质的转导序列(hPER1，序列SRRHHCRSKAKRSRHH)有效越过细胞膜。因此，它是吸引人的抗原递送载体候选物。如下面详细描述的，hPER1实际上增强抗原呈递和T细胞反应性。附图简述附图说明图1.通过hPER1缀合物体外敏化靶细胞进行肽特异裂解。图2.用hPER1缀合物肽体外诱导人T细胞应答。图3.用hPER1缀合物肽不用佐剂体内诱导T细胞应答。图4.静脉内(i.v.)注射肽脉冲的DC后C57BL/6小鼠中的CTL应答。用经所指示的肽脉冲的5×105个骨髓来源的DC静脉内免疫小鼠。免疫后一周从接种的动物收获脾细胞，用SIINFEKL肽再刺激5天，并在标准铬释放测定中用SIINFEKL肽脉冲的靶细胞测试CTL活性。图5.皮下(s.c.)注射肽后HLA-A2/Kb转基因小鼠中的CTL应答。将小鼠用50μg所指示的肽皮下免疫并在第一次注射后第21和42天加强免疫。在免疫后63天收获来自免疫动物的脾细胞，用天然gp100-154肽再刺激5天，并在标准铬释放测定中用gp100-154肽脉冲的靶细胞测试CTL活性。图6.转基因A2/Kb小鼠中hPER1-FVYVW-154介导CTL应答可以通过不同的免疫途径产生。所示结果代表每组的四只个别小鼠的平均值。图7.用缀合SIINFEKL表位的hPER1或者Tat肽体内诱导T细胞应答。用通过DEVWEL接头序列结合于Tat或者hPER1的SIINFEKL肽皮下免疫小鼠。该图中所示结果代表每组的四只个别小鼠的平均值。与IFA中的阳性对照SIINFEKL相比，hPER1-DEVWEL-SIINFEKL得到最佳的CTL应答。图8.辅助CD4乙型肝炎肽的存在对于产生针对CD8肽的CTL应答是必需的。用从50纳摩尔到1纳摩尔的不同剂量的hPER1-FVYVW-154肽用或者不用辅助肽鼻内接种A2/Kb小鼠。不存在辅助肽时，10纳摩尔hPER1-FVYVW-154不诱导显著细胞毒性。图9.不存在辅助肽时，用较高的肽剂量免疫可以在小鼠中诱导T细胞应答。用不同剂量的hPER1-SGQL-SIINFEKL用或者不用辅助肽皮内免疫C57BL/6小鼠。图10.在不同接头序列存在下，用结合SIINFEKL的hPER1进行无佐剂的肽免疫后体内诱导免疫性。结果显示了每组的4只个别小鼠的平均值。FVYVW接头已经产生了最显著的CTL杀伤，其与存在不完全弗氏佐剂(IFA)时的SIINFEKL免疫相当。图11.OVA(SIINFEKL)肽呈递的体外分析。将来自C57BL/6小鼠的脾细胞用10μg/ml所指示的肽在37℃脉冲1小时，洗涤，并温育0、4、8、24或30小时。使用转导肽脉冲的细胞与bGAL肽预温育以阻断任何细胞表面结合。然后通过ELISPOT测试细胞诱导从SIINFEKL特异T细胞分泌IFN-γ的能力。大于300/孔的点数不能计数。*＝未测试的样品。图12.NP肽呈递的体外分析。将来自C57BL/6小鼠的脾细胞用10μg/ml所指示的肽在37℃脉冲1小时，洗涤，并温育0、24、72或120小时。通过ELISPOT测试细胞诱导从NP-特异T细胞分泌IFN-γ的能力。图13.hPER1-FVYVW-gp100-154肽免疫后长期免疫性的诱导。仅用gp100-154肽或者结合hPER1-FVYVW皮下免疫3周或者3个月后A2/Kb小鼠中的CTL应答。结果显示了单个小鼠(4只小鼠/组)。hPEr1-FVYVW-154免疫后分别在4/4或者3/4小鼠中观察到短期(3周)以及长期(3个月)T细胞应答。相比而言，仅用154免疫不产生显著CTL应答。专利技术概述本专利技术提供了用于产生和利用靶定的免疫原的试剂和方法。在优选实施方案中，将免疫原缀合到氨基酸序列，所述序列将免疫原靶向MHC用于呈递。使用本文提供的试剂和方法，可以增强免疫方案，从而导致宿主的增强的免疫性。详述本专利技术提供了用优选将肽导向MHC呈递途径的氨基酸序列(本文中称作“靶向序列”)将免疫原靶向MHC途径的方法。该靶向策略可以用于例如基于肽的免疫方案中，以用于在树突细胞中表达抗原，用于核酸疫苗，和基于载体(即，病毒、细菌)的接种。为了描述本专利技术，将连接到靶向氨基酸序列的免疫原性氨基酸序列称作“靶定的免疫原”。术语“靶定的免疫原”包括其片段、变体或者衍生物。靶向序列可以包括，例如，本领域已知的任意转导序列。优选来自触角足、TAT、VP22或hPER1蛋白的序列(即，靶向序列)。更优选的靶向序列包括例如TATGYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.1)AntPRQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO.2)PER1-1SRRHHCRSKAKRSRHH(SEQ ID NO.3)PER1-2RRHHRRSKAKRSR(SEQ ID NO.4)在一个实施方案中，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位结合到hPER1转导序列以形成靶定的免疫原(或者“hPER1-CTL缀合物”)。优选对宿主施用靶定的免疫原导致抗免疫原免疫应答，其大于仅用该免疫原得到的免疫应答(即，增加的细胞毒性T细胞应答)。适宜的免疫原还可以包括例如，肿瘤抗原(TA)的肽序列。术语“TA”包括肿瘤相关抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
多肽，其基本上由连接到包含细胞毒性Ｔ淋巴细胞表位的第二个氨基酸序列的包含ｈＰＥＲ１的转导序列的第一个氨基酸序列组成，其中所述转导序列是ＲＲＨＨＲＲＳＫＡＫＲＳＲ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AR昂格尔，D萨尔哈，S加利钱，
申请(专利权)人：圣诺菲帕斯图尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]