制备分离基质的方法技术

一种制备分离基质的方法，包括以下步骤：a)提供固体载体和衍生自免疫球蛋白‑结合细菌蛋白的碱稳定性配体；b)使所述碱稳定性配体与所述固体载体反应以形成具有共价偶联的碱稳定性配体的分离基质；和c)用包含至少10 mM的碱金属氢氧化物的洗涤溶液洗涤所述具有共价偶联的碱稳定性配体的分离基质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备分离基质的方法专利技术
本专利技术涉及制造亲和分离基质，和特别地涉及制造包含共价连接的配体的亲和分离基质，所述配体衍生自细菌免疫球蛋白-结合蛋白，例如葡萄球菌属(Staphylococcus)蛋白A(SpA)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)蛋白L(PpL)或链球菌属(Streptococcus)蛋白G(SpG)。本专利技术特别涉及制造包含这些免疫球蛋白-结合蛋白的碱稳定性变体的基质。专利技术背景最重要的新药类型之一是治疗性单克隆抗体(mAb)。在这些的制造中，在包含共价偶联的葡萄球菌属蛋白A(SpA)或SpA的变体的基质上的亲和色谱最普遍用作第一分离步骤以除去大多数源自包含mAb的细胞培养肉汤的污染物。关于最终mAb产品的纯度要求很高，并且重要的是来自基质的SpA配体的任何泄漏被最小化，以避免必须通过后续的色谱步骤除去泄漏的配体。这样的步骤已经描述于例如US6121428、US7223848、US7847071、US20080312425、US8053565和US7714112，其通过引用以其整体并入本文。减少在使用过程中从基质泄漏的配体的量的方法公开于US7485704、US7589183和US20030148540，其也通过引用以其整体并入本文。SpA是细菌免疫球蛋白-结合蛋白(IBP)的类型的成员，如通过EVSidorin和TFSoloveva在Biochemistry(Moscow),vol.76,no.3,p.295-308(2011)中综述的。如上所论述的，SpA是用于全抗体的亲和色谱的最常见的IBP，这是由于其高度选择性结合完整免疫球蛋白的Fc部分。然而，也存在开发缺少Fc部分的抗体片段和其它抗体构建体的强趋势。在该情况下，使用结合Fc部分以外的其它部分的IBP，最特别地是结合κ-型IgG的轻链的大消化链球菌(Peptostreptococcusmagnus)蛋白L(PpL)和结合Fab片段的重链的链球菌属蛋白G(SpG)。在具有IBP配体例如SpA、PpL或SpG的亲和分离基质的制造中，固体载体，例如多孔的载体颗粒，通常被活化以产生能够与IBP配体反应的基团，和活化的载体颗粒然后与IBP配体反应以实现所需的共价偶联。然而由于必须应用一定过量的配体，基质将还包含非共价结合的配体，其可能是游离溶解的，或者与基质物理缔合。游离配体是潜在毒性的，和为了除去这些非共价结合的配体至可忽略或最小泄漏所需的程度，需要大量洗涤操作，这增加制造过程的复杂性和成本。因此，需要制造具有IBP配体例如SpA、PpL或SpG的低泄漏的亲和分离基质的改进方法。专利技术概述本专利技术的一个方面是提供具有IBP配体例如SpA、PpL或SpG的低泄漏的分离基质的有效制造方法。这用包括以下步骤的方法实现：a)提供固体载体和碱稳定性IBP、蛋白A、蛋白L或蛋白G配体；b)使碱稳定性IBP、蛋白A、蛋白L或蛋白G配体与固体载体反应以形成具有共价偶联的碱稳定性IBP、蛋白A、蛋白L或蛋白G配体的分离基质；和c)用包含至少10mM、例如至少25mM的碱金属氢氧化物的洗涤溶液洗涤具有共价偶联的碱稳定性IBP、蛋白A、蛋白L或蛋白G配体的分离基质。碱金属氢氧化物可以是例如NaOH或KOH或其任何混合物。一个优点是在步骤c)中碱性/NaOH/KOH洗涤有效除去任何非共价结合的配体，使得仅需要有限数量的洗涤步骤以降低配体泄漏至可接受的水平。进一步的优点是任何剩余的反应性基团，例如环氧化物基团，通过碱性/NaOH/KOH洗涤而被失活。本专利技术的进一步的合适实施方案在从属权利要求中描述。附图图1显示在不同的洗涤溶液中孵育18h后碱稳定性蛋白A分离基质的剩余静态IgG-结合容量。图2显示在a)5和b)10个后续的10min洗涤步骤期间，从碱稳定性蛋白A分离基质的未结合配体的除去。图3显示在10个NaOH洗涤步骤、3个HAc/EtOH步骤和5个NaAc步骤的顺序期间，从碱稳定性蛋白A分离基质的未结合配体的除去。定义如本文使用的，术语"包含(comprises)"、"包含(comprising)"、"含有"、"具有"等可具有在美国专利法中归属于它们的含义，和可意指"包括(includes)"、"包括(including)"等；"基本上由……组成"或"基本上组成"同样具有在美国专利法中归属的含义，和该术语是开放式的，允许存在所述事物之外的事物，只要所述事物的基本或新特征没有因为存在所述事物以外的事物而改变，但不包括现有技术实施方案。关于氨基酸序列的比较的术语“%同一性”通过标准比对算法确定，例如描述于Altshul等(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410的BasicLocalAlignmentTool(BLASTTM)。对此的基于网络的软件可从USNationalLibraryofMedicine在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiPROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome免费获得。此处，算法“blastp(蛋白-蛋白BLAST)”用于比对问询序列和主题序列，并确定i.a.%同一性。实施方案的详细描述在一个方面，本专利技术公开了一种制备分离基质的方法，包括a)–c)的步骤。该方法也可描述为在制备期间或紧接之后从分离基质除去非共价结合的蛋白A、蛋白L或蛋白G配体的方法。因此，其也是一种制备分离基质的方法，所述基质包含共价偶联的碱稳定性蛋白A、蛋白L或蛋白G配体并且基本上不含非共价偶联的蛋白A、蛋白L或蛋白G配体。a)提供固体载体和碱稳定性蛋白A、蛋白L或蛋白G配体。固体载体可包含多个多孔的载体颗粒，其可例如包含交联多醣，例如琼脂或琼脂糖。多孔的载体颗粒可合适地是珠形状的，例如具有至少0.9的球形度，其中球形度被定义为具有与给定颗粒相同的体积的球体的表面积和所述颗粒的表面积的比率。颗粒的体积加权中值直径(d50,v)可例如是10-200微米，例如20-150微米。下文论述了多孔的载体颗粒的其它性质。或者，固体载体可包含多孔的膜或多孔的整料，例如含纤维的膜，例如无纺纳米纤维膜。下文还进一步论述了碱稳定性蛋白A、蛋白L或蛋白G配体的性质。配体合适地包含能够与固体载体或多孔的载体颗粒上的反应性基团化学反应的氨基酸残基。这样的氨基酸残基可以是具有反应性胺的赖氨酸、具有反应性咪唑的组氨酸和/或具有反应性硫醇的半胱氨酸。b)使碱稳定性蛋白A、蛋白L或蛋白G配体与固体载体或多孔的载体颗粒反应以形成具有共价偶联的碱稳定性蛋白A、蛋白L或蛋白G配体的分离基质。步骤b)之前可以是活化固体载体或多孔的载体颗粒的步骤a’)。这可例如包括在载体颗粒上形成醛或环氧化物基团，例如通过高碘酸盐氧化邻近二醇或通过与表氯醇或双官能环氧化物例如丁二醇二缩水甘油醚反应进行。醛基团可用于通过还原胺化来偶联配体上的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备分离基质的方法，包括以下步骤：/na) 提供固体载体和衍生自细菌免疫球蛋白-结合蛋白的碱稳定性配体；/nb) 使所述碱稳定性配体与所述固体载体反应以形成具有共价偶联的碱稳定性配体的分离基质；和/nc) 用包含至少10 mM的碱金属氢氧化物，例如NaOH或KOH或其任何混合物的洗涤溶液洗涤所述具有共价偶联的碱稳定性配体的分离基质。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171220 GB 1721476.81.一种制备分离基质的方法，包括以下步骤：
a)提供固体载体和衍生自细菌免疫球蛋白-结合蛋白的碱稳定性配体；
b)使所述碱稳定性配体与所述固体载体反应以形成具有共价偶联的碱稳定性配体的分离基质；和
c)用包含至少10mM的碱金属氢氧化物，例如NaOH或KOH或其任何混合物的洗涤溶液洗涤所述具有共价偶联的碱稳定性配体的分离基质。


2.权利要求1的方法，其中所述衍生自细菌免疫球蛋白-结合蛋白的碱稳定性配体是碱稳定性蛋白A配体。


3.权利要求1的方法，其中所述衍生自细菌免疫球蛋白-结合蛋白的碱稳定性配体是碱稳定性蛋白L配体。


4.权利要求1的方法，其中所述衍生自细菌免疫球蛋白-结合蛋白的碱稳定性配体是碱稳定性蛋白G配体。


5.任何前述权利要求的方法，其中所述固体载体包含多个载体颗粒，例如多个多孔的载体颗粒。


6.任何前述权利要求的方法，其中步骤c)重复至少1次。


7.任何前述权利要求的方法，其中步骤c)重复至少5次。


8.任何前述权利要求的方法，进一步包括在步骤c)之后，转移所述分离基质至储存溶液的步骤d)。


9.权利要求8的方法，进一步包括在步骤d)之后，分配所述分离基质到运输容器中的步骤。


10.任何前述权利要求的方法，其中步骤c)在步骤b)之后的24h内进行。


11.任何前述权利要求的方法，其中在步骤c)中，所述洗涤溶液包含25mM–1M的碱金属氢氧化物，例如NaOH或KOH或其任何混合物。


12.任何前述权利要求的方法，其中在步骤c)中，所述洗涤溶液包含40mM–1M的碱金属氢氧化物，例如90mM–0.5M的碱金属氢氧化物，或50–200mM的碱金属氢氧化物。


13.任何前述权利要求的方法，其中在步骤c)中，所述洗涤溶液包含40mM–1MNaOH或KOH，例如90mM–0.5MNaOH或KOH，或50–200mMNaOH或KOH。


14.任何前述权利要求的方法，其中在步骤c)中，在2-60min，例如5-30min期间用洗涤溶液孵育所述分离基质。


15.权利要求14的方法，其中在孵育之后，通过过滤除去所述洗涤溶液。


16.任何前述权利要求的方法，其中在步骤c)中，温度是2-40℃，例如15-30℃或20-25℃。


17.任何前述权利要求的方法，进一步包括在步骤b)之前，活化所述固体载体的步骤a’)。


18.权利要求17的方法，其中步骤a’)包括在所述固体载体上形成醛基团。


19.权利要求17的方法，其中步骤a’)包括在所述固体载体上形成环氧化物基团。


20.权利要求19的方法，其中在步骤b)之后，所述分离基质包含残留的环氧化物基团。


21.权利要求15–17中任一项的方法，其中所述衍生自细菌免疫球蛋白-结合蛋白的碱稳定性配体包含能够与所述醛或环氧化物基团反应的赖氨酸残基。


22.权利要求19或20的方法，其中所述衍生自细菌免疫球蛋白-结合蛋白的碱稳定性配体包含具有能够与所述环氧化物基团反应的硫醇的半胱氨酸残基。

【专利技术属性】
技术研发人员：G罗德里格，M安德尔，R帕姆格伦，T比约克曼，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE