白蛋白变体和缀合物制造技术

本发明专利技术涉及白蛋白变体和缀合物。基于白蛋白的三维结构，发明专利技术人设计了具有一个或多个带有游离巯基的半胱氨酸残基的变体多肽(mutein)(下文中称作“硫代白蛋白”)。变体多肽可以通过半胱氨酸残基的硫原子与缀合配偶体如生物活性化合物缀合。

Albumin variants and conjugates

The present invention relates to albumin variants and conjugates. Based on the three-dimensional structure of albumin, the inventor designed a variant polypeptide (mutein) (hereinafter referred to as thiosulfate) with one or more cysteine residues with free sulfhydryl groups. The mutant polypeptide can be conjugated with a conjugated partner, such as a bioactive compound, by sulfur atoms of cysteine residues.

【技术实现步骤摘要】
白蛋白变体和缀合物本专利技术申请是基于申请日为2010年2月11日，申请号为201080007427.4(国际申请号为PCT/EP2010/051751)，名称为“白蛋白变体和缀合物”的专利技术专利申请的分案申请。对序列表的涉及本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过提述并入本文。专利
本专利技术涉及能缀合的白蛋白(conjugationcompetentalbumin)和白蛋白相关多肽，和它们与至少一种模块(moiety)的缀合物，并且涉及编码它们的多核苷酸。专利技术背景血清白蛋白为可以融合的生物活性分子提供有价值的支架，其或者通过遗传融合或者通过化学融合以改善融合分子的性质(Leger,R.等(2004).BioorgMedChemLett14(17):4395-8；Thibaudeau,K.,等(2005).BioconjugChem16(4):1000-8；Balan,V.等(2006).AntivirTher11(1):35-45；EP0413622；WO90/13653；EP1681304；WO1997/024445；WO01/79271)。白蛋白和白蛋白颗粒对于将药物和前药携带并递送至它们的作用位点也很重要(Kratz(2008)JournalofControlledRelease,132(3),p.171-183)。鉴于改进的药代动力学性质，如半衰期的延长，融合和颗粒技术提供了改进的剂量给药方案，并可以改进生物利用度且保护所述融合的生物活性分子免于失活。白蛋白的生物化学、遗传学和医学应用是得到充分表征的(“AllaboutAlbumin”,T.PetersJr.,AcademicPressN.Y.,和http://www.albumin.org/)。人血清白蛋白(HSA，也称作HA)以～60g/L而是人血浆中最丰富的蛋白质。HSA的序列在SEQIDNo.1中提供。存在HSA的天然变体并且在Minchiotti等(2008).HumMutat29(8):1007-16中和http://www.uniprot.org/uniprot/P02768上给出了已知的多态性的列表。重组人血清白蛋白的产生和纯化是完善的(WO95/23857；WO00/44772；WO2006/066595；EP0305216；Sleep等1990Biotechnology(NY).1990Jan；8(1):42-6))并且包括用于药物应用的重组人血清白蛋白(Bosse等(2005).JClinPharmacol45(1):57-67)。HSA的三维结构已经通过X射线晶体学得到了阐明(Carter等(1989).Science244(4909):1195-8；Sugio等(1999).ProteinEng12(6):439-46)。HSA多肽链具有35个半胱氨酸残基，其形成17个二硫键和一个在成熟蛋白(SeqIDNo.1)的34位的不成对(游离)的半胱氨酸。半胱氨酸-34已经用于将分子缀合至白蛋白(Leger等(2004)BioorgMedChemLett14(17):4395-8；Thibaudeau等(2005).BioconjugChem16(4):1000-8)，并提供了精确的、明确确定的缀合用位点。然而，在半胱氨酸34处的缀合仅提供了一个用于附接单一模块的位点，因此对缀合位点没有选择。另外，提供单一缀合位点意味着只有一个模块能够与每个白蛋白分子缀合。需要的是提供一个或多个可供选择的附接位点的白蛋白分子。
技术实现思路
基于对人血清白蛋白(HSA)三维结构的分析，白蛋白多肽及其天然多态性中的保守残基，专利技术人设计了白蛋白的变体多肽(mutein)，其具有一个或多个能缀合的半胱氨酸残基。术语“硫代白蛋白”在本文用于描述包含一个或多个不成对的半胱氨酸残基的白蛋白变体，特别是其中所述不成对的半胱氨酸残基中的一个或多个不存在于白蛋白天然存在的变体中的白蛋白变体。因此，硫代白蛋白是“能缀合的白蛋白”。硫代白蛋白可以称作“白蛋白的半胱氨酸变体”。在本说明书全文中，术语“白蛋白”包括天然存在的白蛋白、白蛋白相关蛋白及其变体，如天然的和工程化的变体。变体包括多态性、片段如结构域和亚结构域、片段和/或融合蛋白。所述白蛋白可以与SEQIDNo.1具有至少40,50,60,70,80,90,95,96,97,98,99％相似性或同一性。因此，本专利技术的硫代白蛋白可以是任何这样的白蛋白的衍生物，或是基于任何这样的白蛋白。不成对的半胱氨酸残基可以由插入、缺失、取代、添加或延伸白蛋白序列来提供。本专利技术还涉及包含至少一个，例如2、3、4、5或6个，缀合配偶体(conjugationpartner)如生物活性化合物和根据本专利技术的多肽的缀合物。本专利技术还提供用于设计能缀合的白蛋白的方法。具体地，本专利技术涉及如下各项：1.一种制备能缀合的多肽的方法，包括：a)提供包含至少一例白蛋白序列的三维结构模型，并且任选地提供该白蛋白序列的氨基酸序列，b)在所述白蛋白序列中选择氨基酸残基，其对应于相对所述模型的或所述氨基酸序列的序列的N端或C端的第1、2、3、4或5个残基或其在涉及三维结构模型的所述白蛋白序列的各种情况下满足以下条件：i)至少80％的溶剂表面可及性；ii)至少30的B因子得分；iii)没有已知引起热不稳定性的多态性；c)用半胱氨酸取代选择的残基或在选择残基的N端侧或C端侧插入半胱氨酸，d)任选地，对所述白蛋白序列进行额外的变化，其中每个变化为氨基酸缺失、取代或插入；和e)制备具有所得氨基酸序列的多肽。2.根据项1的方法，其中所述残基是：a)不在二级结构内，并且任选地，B因子为至少60和/或任选地表面可及性为至少90％；b)在二级结构内，并且任选地，B因子为至少40和/或任选地表面可及性至少为90％；c)不在二级结构内，并且任选地，B因子为至少50；或d)在二级结构内，并且任选地，B因子为至少30。3.通过项1或2的方法可获得的能缀合的多肽。4.根据项3的能缀合的多肽，其包含与SEQIDNo.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：a)在与SEQIDNo.1的位置34等同的位置，存在能缀合的半胱氨酸残基；并且b)在所述多肽中的其他位置，存在两个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。5.根据项3的能缀合的多肽，其包含与SEQIDNo.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：a)在与SEQIDNo.1的位置34等同的位置，不存在能缀合的半胱氨酸残基；并且b)在所述多肽中的其他位置，存在三个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。6.一种能缀合的多肽，其包含与SEQIDNo.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：a)在与SEQIDNo.1的位置34等同的位置，存在能缀合的半胱氨酸残基；并且b)在所述多肽中的其他位置，存在两个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。7.一种能缀合的多肽，其包含与SEQIDNo.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：a)在与SEQIDNo.1的位置34等同的位置，不存在能缀合的半胱氨酸残基；并且b)在所述多肽中的其他位置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能缀合的多肽，其包含与SEQ ID No.1的残基1‑585至少90％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：a)在与SEQ ID No.1的位置34等同的位置，存在能缀合的半胱氨酸残基；并且b)在所述多肽中的其他位置，存在两个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。

【技术特征摘要】
2009.02.11 EP 09152625.1;2009.02.12 EP 09152686.31.一种能缀合的多肽，其包含与SEQIDNo.1的残基1-585至少90％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：a)在与SEQIDNo.1的位置34等同的位置，存在能缀合的半胱氨酸残基；并且b)在所述多肽中的其他位置，存在两个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。2.一种能缀合的多肽，其包含与SEQIDNo.1的残基1-585至少90％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：a)在与SEQIDNo.1的位置34等同的位置，不存在能缀合的半胱氨酸残基；并且b)在所述多肽中的其他位置，存在三个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。3.根据权利要求1或2的能缀合的多肽，其中所述能缀合的半胱氨酸残基提供于选自白蛋白序列中对应于相对SEQIDNO:1的序列的N端或C端的第1、2、3、4或5个残基的氨基酸残基的位置，或其满足以下条件：i)至少80％的溶剂表面可及性；ii)至少30的B因子得分；iii)没有已知引起热不稳定性的多态性。4.根据权利要求1-3中任一项的能缀合的多肽，其包含在一个或几个位置的能缀合的半胱氨酸残基，所述一个或几个位置选自38、40、48、52、55、56、58、60、63、76、79、80、81、82、83、86、89、92、94、96、104、109、111、113、114、115、116、118、119、121、122、125、129、130、170、172、227、229、266、269、270、273、280、282、283、294、297、298、300、301、303、304、308、311、313、314、318、320、321、324、325、355、362、364、365、368、371、375、379、386、390、396、397、439、441、442、443、467、468、469、471、478、479、483、490、492、495、496、498、499、500、501、503、504、505、506、508、510、512、515、538、539、541、542、546、549、550、560、562、564、565、566、573、574、577、578、580、581和582。5.根据权利要求3的能缀合的多肽，其中所述能缀合的半胱氨酸残基提供于选自满足以下条件的位置：a)不在二级结构内，并且任选地，B因子为至少60和/或任选地表面可及性为至少90％；b)在二级结构内，并且任选地，B因子为至少40和/或任选地表面可及性至少为90％；c)不在二级结构内，并且任选地，B因子为至少50；或d)在二级结构内，并且任选地，B因子为至少30。6.根据权利要求5的能缀合的多肽，其包含在一个或几个位置的能缀合的半胱氨酸残基，所述一个或几个位置选自79、80、86、300、301、313、314、362、364、365、371、495、496、498、501、504、505、506、508、512、538、539、541、560、562和564。7.根据权利要求5的能缀合的多肽，其包含在一个或几个位置的能缀合的半胱氨酸残基，所述一个或几个位置选自55、56、58、60、79、80、82、83、86、89、94、111、113、115、116、118、121、129、269、270、273、280、282、300、301、303、304、308、311、313、314、318、320、324、325、362、364、365、368、371、375、386、390、397、439、441、442、443、467、468、469、471、479、495、496、498、501、504、505、506、508、512、515、538、539、541、542、549、550、560、562、564、574、577、578和581。8.根据权利要求5的能缀合的多肽，其包含在一个或几个位置的能缀合的半胱氨酸残基，所述一个或几个位置选自58、59、60、79、80、85、86、87、88、89、113、114、115、116、298、299、300、301、302、303、304、305、310、311、312、313、314、322、361、362、363、364、365、370、371、372、399、439、440、441、442、443、444、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、534、535、536、537、538、539、540、541、559、560、561、562、563、564、565和582。9.根据权利要求5的能缀合的多肽，其包含在一个或几个位置的能缀合的半胱氨酸残基，所述一个或几个位置选自6、12、37、38、39、40、40、41、48、52、53、54、55、76、77、78、81、82、83、84、99、100、104、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、131、132、133、166、167、168、174、204、205、212、228、229、230、234、262、263、264、265、266、268、269、270、271、283、284、285、286、287、288、289、290、291、306、307、308、309、315、316、317、318、319、320、321、323、324、325、326、327、328、329、332、334、335、336、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、366、367、368、369、373、374、375、376、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、400、401、402、403、404、405、408、409、410、411、413、414、425、427、428、430、431、434、435、436、437、445、446、447、448、449、464、465、466、471、472、473、474、475、478、479、490、518、519、520、521、522、523、524、525、526、528、529、530、531、532、533、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580和581。10.根据权利要求1或2的能缀合的多肽，其包含在一个或几个位置的能缀合的半胱氨酸残基，所述一个或几个位置选自1、2、4、58、60、79、80、86、113、115、116、298、300、301、303、304、313、314、364、365、371、439、443、496、498、501、503、504、505、506、512、538、541、560、562、564、565、582、584和585。11.根据权利要求10的能缀合的多肽，其包含在一个或几个位置的能缀合的半胱氨酸残基，所述一个或几个位置选自1、2、79、86、364、504、505、562、585。12.根据权利要求1或2的能缀合的多肽，其包含在一个或几个位置的能缀合的半胱氨酸残基，所述一个或几个位置选自38、40、48、52、55、76、82、83、104、121、122、125、129、229、266、269、270、283、308、318、320、321、324、325、355、368、375、379、386、390、396、397、471、478、479、490、542、546、549、550、566、573、574、577、578、580和581。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·J·A·芬尼斯，J·M·海，E·P·弗里伊斯，J·卡梅隆，D·斯里普，
申请(专利权)人：阿尔布梅迪克斯医疗公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK