对番茄灰霉病菌具强致病力的淡紫紫孢菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种对番茄灰霉病菌具强致病力的淡紫紫孢菌（

The purple purple spore strains with strong pathogenicity of Botrytis cinerea and its application with

The invention relates to a purple purple spore strains with strong pathogenicity of Botrytis cinerea (

【技术实现步骤摘要】
对番茄灰霉病菌具强致病力的淡紫紫孢菌菌株及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种对番茄灰霉病菌具强致病力的淡紫紫孢菌（Purpureocilliumlilacinum）菌株及其应用。
技术介绍
灰霉病是一种世界性的重要病害，它可侵染200多种植物的花、果实及其他绿色组织，导致植物组织腐烂，丧失利用价值。近年来，灰霉病在中国大面积的发生，已严重阻碍了蔬菜产量的提高。其中茄科蔬菜以番茄受害最重，番茄灰霉病的防治已成为保护生产发展的关键性措施，直接决定着番茄的产量和经济效益。灰霉病菌在番茄上主要以菌核在土壤中或以菌丝及分生孢子在病残体上越冬或越夏。该病害为气传病害，主要靠分生孢子随气流、灌溉水和农具等传播，花期是侵染的高峰期。第二年春天条件适宜时，菌核萌发，产生菌丝体和分生孢子梗及分生孢子。分生孢子成熟后脱落，借气流、雨水或露珠及农事操作进行传播。萌发时产出芽管，从寄主伤口或衰老的器官、枯死的组织上侵入，也可由表皮直接侵染引起发病，潮湿时病部产生大量的分生孢子可进行再侵染。低温、高湿是发病的必要条件，尤其高湿是病害发生发展的主导因素，温度在15℃左右，相对湿度在80%是发病的起始条件。目前，对于番茄灰霉病菌的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和番茄灰霉病菌产生抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治番茄灰霉病菌也逐渐引起人们的重视。番茄灰霉病的生物防治以活体微生物或其代谢产物的研究较多，已有的研究结果表明，许多土壤、叶围、根围及内生微生物甚至包括一些植物病原物对灰霉病菌均有一定程度的抑制作用。当前用于防治灰霉病菌的生防真菌有绿色木霉(Trichodermaviride)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、木素木霉(Trichodermalignorum)、出芽梗短霉(Aureobasidiumpullulans)、浅白隐球酵母(Crypto-coccusalbidus)、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、球毛壳(Chaetomiumglobosum)、粘帚霉(Gliocladiumspp.)等，细菌主要有芽孢杆菌属如(Bacsllussutizis)、多粘芽孢杆菌(Baeilluspolymyxa)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、乳芽孢杆菌(Lactobaeillussp)、短体芽孢杆菌(Baeslluspumilus)、嗜麦芽黄单孢菌(Xanthomonasmaltophilia)、假单孢杆菌(PeudomonasSp.)、荧光假单孢菌(Peudomonasjluoreseens）等。然而，目前对于番茄灰霉病菌生防菌的研究多处于实验室阶段，尚未在农业生产中对番茄灰霉病菌达到有效防治，亟待进一步分离筛选或诱导驯化出能有效应用的有益菌株，并进行生物潜能的深入研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株对番茄灰霉病菌具有强致病力的淡紫紫孢菌菌株，该菌株作为生物农药，具有良好的市场应用前景。为解决以上问题，本专利技术通过以下技术方案实现：在已分离、筛选所得的原始菌株pl36-1基础上，专利技术人进一步通过根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化而获得的突变菌株pt362，并于2016年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编430072），保藏编号为CCTCCNO：M2016682。本专利技术还公开了该淡紫紫孢菌菌株pt362在防控番茄灰霉病中的应用，以及在制备用于防治番茄灰霉病菌的生物农药中的应用，菌株的分生孢子悬浮液及代谢产物对番茄灰霉病菌具有强致病力。与现有技术相比，本专利技术具有以下积极有益的技术效果：（1）本专利技术淡紫紫孢菌菌株pt362是一种线虫病原生防真菌，可制成生防菌制剂用于对番茄灰霉病菌的生物防治，较目前防治番茄灰霉病菌的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征。（2）本专利技术淡紫紫孢菌菌株pt362繁殖力强，培养速度快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。（3）本专利技术淡紫紫孢菌菌株pt362的孢子悬浮液和代谢产物对番茄灰霉病菌具有很强的致病力。附图说明图1淡紫紫孢菌菌株pt362对番茄灰霉病菌的拮抗效果（PDA平板）；图2淡紫紫孢菌菌株pt362代谢产物对番茄灰霉病菌的拮抗效果。具体实施方式下面结合实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂如无特别说明，均为市售。实施例1：淡紫紫孢菌菌株pt362的培养、驯化淡紫紫孢菌原始菌株pl36-1王明祖老师1991年在湖北省从根结线虫体内分离得到（参见1991年发表在《植物病理学报》名为“根结线虫卵寄生真菌的研究初报”的文章），保存于华中农业大学植物病理线虫研究室。pt362是通过根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化而获得的突变菌株。转化子遗传稳定性的方法参考曾大兴的方法。大致如下：在不含草丁膦和萎锈灵的PDA平板上接种淡紫紫孢菌转化菌株，28℃，恒温黑暗培养3-5天后，接着转移到4℃冰箱，放置2天，再然后28℃，恒温黑暗培养3-5天，用打孔器挑取菌落边缘菌丝接种到新的PDA平板上培养，如此连续转接10代，再接种到含4.5mg/mL草丁膦+400μg/mL萎锈灵的PDA平板上，28℃，恒温黑暗培养，记录插入突变子菌落生长情况（曾大兴等2005）。试验结果表明，经过转代10次驯化后的插入突变子仍旧可以在含草丁膦和萎锈灵的PDA平板上正常生长，说明淡紫紫孢菌的插入突变子在无性繁殖过程中，bar和抗萎锈灵基因并未丢失，具有较高的遗传稳定性。实施例2：淡紫紫孢菌菌株pt362对番茄灰霉病菌的拮抗效果（PDA平板）淡紫紫孢菌/番茄灰霉病菌制备：用直径0.5cm的打孔器在玻璃培养皿上已生长满菌丝的淡紫紫孢菌/番茄灰霉病菌菌落边缘打孔，用接种针将菌块接入到已冷却的平板中，28℃培养、待用。PDA平板制备：将融好的PDA培养基冷却到30℃左右，倒平板。静置1～2h。接种：用直径0.5cm的打孔器在玻璃培养皿上已生长3d的番茄灰霉病菌菌丝边缘打孔，用接种针将菌块接入到已冷却的平板中(十字交叉法)。淡紫紫孢菌接种于平板中间，25℃培养、观察、统计抑制效果。结果见图1，（a：灰霉菌；b：原始菌株和灰霉菌拮抗效果；c：突变菌株pt362和灰霉菌的拮抗效果。）可以看出淡紫紫孢菌对番茄灰霉病菌有强烈的抑制作用。实施例3：淡紫紫孢菌菌株pt362代谢产物对灰霉病菌的拮抗效果淡紫紫孢菌发酵液制备：在装有150mLPDB培养基的250mL三角瓶中接入直径0.5cm的淡紫紫孢菌菌块，28℃，200r/min摇床培养，培养6d。取发酵液，10000r/min离心15min，取上清液用细菌过滤器过滤。所得到的液体即为原液。用无菌水稀释把原液稀释8倍。接种：用选用叶龄相同、大小一致的健康叶片，用无菌水洗净、备用。将番茄叶片浸泡在上述不同浓度的发酵液里20分钟左右。在叶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淡紫紫孢菌（

【技术特征摘要】
1.一种淡紫紫孢菌（Purpureocilliumlilacinum）菌株pt362，其保藏编号为CCTCCNO：M2016682。2.权利要求1所述的淡紫紫孢菌菌株pt362在番茄灰霉病中...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨凡，史宣杰，肖炎农，马凯，赵秀山，李艳，蔡毓新，王彬，高显敏，
申请(专利权)人：河南省农业科学院园艺研究所，华中农业大学，驻马店市农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41